Applications et flux de travail NGS

Le séquençage de l’exome entier (WES) est une application NGS spécifique qui fournit une couverture ≥ 95 % des régions codant pour les protéines (exprimées) du génome. Les régions exoniques et adjacentes non traduites (RTU) représentent environ 1 % du génome, mais abritent la majorité (85 %) des variants pathogènes.⁵ Le WES est particulièrement bien adapté à la détection des SNP et des indels, mais est également capable de fournir des informations sur les CNV et les variants structurels. Bien que le flux de travail de préparation des échantillons de WES (qui nécessitent un enrichissement avec des sondes exome) soit plus complexe que pour le WGS, il offre un coût de séquençage significativement plus faible et une charge d’analyse réduite. Le WES est désormais couramment utilisé dans :

• La recherche sur les maladies mendéliennes
• La recherche de maladies pédiatriques, rares et complexes - en particulier lorsque les investigations sur un gène unique ou sur un petit panel n'ont pas permis d'obtenir une cause génétique possible
• La recherche en oncologie

Les ensembles de sondes de séquençage d'exome ont des tailles de cible de l’ordre de 30 à 60 Mb. Les panels d'exomes plus petits peuvent se concentrer sur le contenu exploitable, tandis que les tailles de cibles plus grandes comprennent généralement un contenu non codant plus adjacent pour permettre la découverte de nouveaux variants. Les bases de données et les algorithmes utilisés pour la conception/sélection des sondes permettent essentiellement de s’assurer que toutes les mutations d’intérêt sont couvertes de manière adéquate et minimiser l’optimisation empirique. 

Roche fournit des solutions de bout en bout hautement optimisées pour le séquençage de l’exome à l’aide de flux de travail manuels et automatisés de préparation d’échantillons.  

• Les sondes de séquençage d'exome se fondent sur les bases de données génétiques les plus récentes, conçues et sélectionnées de manière experte, et optimisées empiriquement pour les préparations chimiques d’échantillons de Roche.
• Chaque lot de sondes de séquençage d'exome subit des tests de contrôle qualité (CQ) fonctionnel pour assurer la qualité et la cohérence.
• Le flux de travail facile à automatiser KAPA HyperCap Evolved permet une construction rationalisée de banques de haute qualité. Un flux de travail de préparation des échantillons de WES validé analytiquement pour le système AVENIO® Edge offre une automatisation vraiment complète. 
• Des banques de haute qualité et une conception de sonde supérieure garantissent d’excellentes mesures d’enrichissement des cibles, une couverture uniforme élevée et de faibles taux de duplication ; tous ces éléments contribuent à l’efficacité et à l’économie du séquençage.⁴
• L’intégration facile des analyses et des rapports secondaires et tertiaires, disponibles via des collaborations tierces et le navify® Mutation Profiler de Roche, garantit des appels de variants fiables et des rapports compréhensibles.

Le séquençage ciblé fait généralement référence à l’analyse de régions génomiques d’intérêt définies et relativement petites (< 10 Mb) à l’aide du séquençage de nouvelle génération (NGS). La réduction de la taille ciblée permet une couverture très approfondie (analyse précise des variants à basse fréquence) et/ou une réduction du coût de séquençage par échantillon. Le séquençage ciblé peut être effectué avec des panels de sondes ou des tests préconçus/validés analytiquement, ou avec un contenu défini par l’utilisateur. Des stratégies basées sur l'hybridation et l'amplicon sont utilisées pour préparer et enrichir des banques. Le séquençage ciblé est largement utilisé dans :

• La recherche en oncologie, en particulier pour suivre les mutations pilotes
• Le profilage génomique complet (PGC) pour analyser les variants germinaux ou somatiques exploitables
• L'analyse et la surveillance des maladies infectieuses
• Typage de l'antigène leucocytaire humain (HLA) et autres applications de recherche pharmacogénomique

Le contenu et les performances de la sonde sont essentiels au succès du séquençage ciblé. Les ensembles de sondes doivent être conçus pour s’assurer que tous les variants souhaités sont couverts à la profondeur souhaitée dans toutes les régions d’intérêt, dont certaines peuvent poser des défis importants en termes de spécificité et d’uniformité.

Roche propose une gamme de solutions pour un séquençage ciblé polyvalent et de haute confiance.

• Notre outil HyperDesign convivial et assisté par un expert simplifie la conception de panels de NGS personnalisés. Avec HyperDesign, vous pouvez créer des panels de sondes hautement performants pour presque toutes les régions d’intérêt ne nécessitant pas d’optimisation empirique étendue⁴
• Les panels Catalog Design Share sont préconçus en collaboration avec des chercheurs de premier plan pour une couverture optimale du contenu pertinent dans les domaines de recherche populaires
• Faites votre choix parmi le flux de travail KAPA HyperCap Evolved Workflow basé sur l’hybridation ou le flux de travail KAPA HyperPETE basé sur les amplicons pour obtenir une préparation d’échantillons rationalisée et robuste qui convient le mieux à la portée, aux objectifs et aux contraintes opérationnelles de votre projet
• La récupération élevée des molécules avec la ligase KAPA EvoT4 et l’amplification haute fidélité à faible biais avec le KAPA EvoAmp ReadyMix atténuent la distorsion de contenu, même lors de la préparation de banques à partir d’échantillons à faible entrée et difficiles
• Les kits de tests oncologiques AVENIO fournissent des solutions validées et faciles à mettre en œuvre de bout en bout pour le profilage tumoral, le PGC, la surveillance et la surveillance en interne

Le transcriptome est composé de nombreuses populations différentes de molécules d’ARN, y compris l’ARNm, l’ARNr, l’ARNt et d’autres ARN non codants (tels que le microARN et l’ARNlnc). Contrairement au génome, il peut fournir des informations précieuses sur le comportement cellulaire à un moment particulier, que ce soit au repos ou lors de la réponse aux changements de l'environnement, aux traitements thérapeutiques ou à la progression du développement. Le séquençage de l’ARN (ARN-seq) est une méthode puissante pour étudier le transcriptome entier ou des parties sélectionnées dans des tissus ou des cellules uniques, pour :

• Identifier les gènes qui sont exprimés différemment dans des populations cellulaires distinctes et quantifier leur abondance relative
• Déterminer les effets des événements d’épissage génétique des variants
• Identifier les nouvelles transcriptions
• Détecter les fusions de gènes, les isoformes et d’autres variants structurels
• Identifier les polymorphismes mononucléotidiques (SNP)

Une grande variété de flux de travail ARN-seq a été développée pour soutenir différents objectifs expérimentaux et types d’échantillons (y compris les données d’entrée et la qualité disponibles). Pour maximiser la détection des transcrits en faible quantité et réduire les coûts globaux de séquençage, de nombreux flux de travail intègrent une étape d’enrichissement ou d’épuisement afin de supprimer les transcrits très abondants et peu informatifs.

Roche prend en charge les flux de travail ARN-seq pour le séquençage du transcriptome entier (WTS ; analyse des transcrits codants et non codants) et ARNm-seq (analyse des transcrits codants uniquement), avec la trousse KAPA RNA EvoPrep et un choix de stratégies d’appauvrissement/d’enrichissement (figure ci-dessous). Le kit KAPA RNA EvoPrep offre une préparation de banque rationalisée et robuste à partir d’un large éventail d’échantillons, y compris des entrées de faible nanogramme et de l’ARN de faible qualité provenant de tissus FFPE.

Les applications de NGS évoluent constamment à mesure que des produits chimiques de préparation d’échantillons, des technologies de séquençage et des outils bioinformatiques nouveaux et raffinés sont lancés. Les applications émergentes passionnantes comprennent :

• L’utilisation de l’intelligence artificielle (IA) dans l’analyse des données de NGS
• Multi-omiques, axées sur l'analyse simultanée de l'ADN, de l'ARN, des protéines et/ou des signatures épigénétiques d'échantillons en vrac ou de cellules uniques
• Tests de contrôle qualité pour les technologies d’édition génique ou de base CRISPR et autres
• Génomique/biologie spatiale

Le large éventail de solutions de préparation, de séquençage et d’analyse des échantillons de Roche est capable de préserver les molécules modèles et de minimiser les biais expérimentaux et analytiques. Cela permet à nos clients d’extraire des informations plus fiables à partir d’un plus large éventail d’intrants et de types d’échantillons pour la recherche clinique, la biotechnologie, l’agriculture et d’autres applications, comme en témoignent les milliers de publications examinées par des pairs citant nos produits de NGS.⁴

Les applications de NGS pour la préparation d’échantillons qui ont récemment été démontrées ou sont actuellement validées comprennent :

• L'analyse fiable des échantillons de biopsie liquide
• La compatibilité de nos chimies de séquençage de l’exome avec les flux de travail Trinity™ et Cloudbreak Freestyle™ sur les séquenceurs Element Biosciences™ AVITI™
• La compatibilité de KAPA EvoPrep avec les flux de travail de conversion par méthylation pour le profilage épigénétique
• La détection complète des fusions à partir d’échantillons de tissus FFPE à faible entrée avec des sondes KAPA HyperExome V2
• Le flux de travail intégré pour le séquençage de l’exome à partir de l’ADN et de l’ARN
• Le séquençage ultra-rapide et efficace de l’exome et le séquençage ciblé avec le flux de travail KAPA HyperCap Evolved Workflow pour les échantillons urgents