KAPA RNA EvoPrep Kits

Das in einem mRNA-Erfassungsworkflow verwendete Poly(A)-Erfassungsverfahren ist nützlich, wenn spezifisch mRNA-Spezies abgefragt werden. Der Workflow weist jedoch einen Bias in Richtung exonischer Transkripte auf. Das Poly(A)-Erfassungsverfahren neigt aufgrund der 3'-Polyadenylierung von mRNA-Transkripten auch zu einer reduzierten 5'-Abdeckung von Transkripten.

Die Verwendung der KAPA RNA EvoPrep Kits mit RiboErase (HMR) und/oder RiboErase (HMR) Globin ermöglicht eine genauere Darstellung des gesamten Transkriptoms und enthält alle RNA-Spezies außer rRNA und/oder Globin. Bei diesem Workflow bleiben intronische und intergene Regionen erhalten, in denen viele lange nicht-kodierende Transkripte vorkommen.

Darüber verhindert das Poly(A)-Erfassungsverfahren die Verwendung mit abgebauter RNA, da die Möglichkeit von Strangbrüchen zwischen der 3'-polyadenylierten Region und dem Rest des Transkripts besteht.

Wenn Sie eines unserer KAPA RNA Hyper oder Stranded RNA-Seq Kits entweder mit mRNA-Erfassung oder rRNA- und/oder Globin-Transkript-Depletion verwenden, finden Sie die technische Dokumentation über unsere Online-Ressource.

Nein, diese Kits sind nicht kompatibel mit Small RNA.

KAPA RNA EvoPrep Kits (ohne Voranreicherung) und KAPA RNA EvoPrep Kits mit RiboErase (HMR) und/oder RiboErase (HMR) Globin sind kompatibel mit RNA, die aus formalinfixiertem, paraffineingebettetem (FFPE) Gewebe extrahiert wurde. Die Qualität von FFPE-abgeleiteter RNA kann aufgrund der schädlichen Natur des Formalinfixierungsprozesses, bei dem Vernetzung, chemische Modifikation und Fragmentierung auftreten können, sehr variabel sein. Die Ergebnisse des Library-Aufbaus können je nach Eingabemenge und Qualität der RNA variieren. Höhere RNA-Eingaben können den Library-Aufbau bei besonders schwierigen FFPE-Proben ermöglichen. Beachten Sie die Empfehlungen in den Gebrauchsanweisungen der jeweiligen Kits

KAPA mRNA EvoPrep Kits sind nur für die mRNA-Erfassung und den Library-Aufbau anhand von hochwertigem Eingabematerial (RNA-Integritätsnummer (RIN) ≥ 7) geeignet. Die Verwendung fragmentierter RNA führt zu einem starken Bias zum 3'-Ende der mRNA.

KAPA RNA EvoPrep Kits (ohne Voranreicherung) sind mit jeder Spezies kompatibel. KAPA mRNA EvoPrep Kits sind mit jeder Spezies mit 3’-Poly-A-Schwänzen kompatibel.

KAPA RNA EvoPrep Kits mit RiboErase (HMR) oder RiboErase (HMR) Globin sind kompatibel mit ribosomaler humaner, Maus- und Ratten-RNA (rRNA) und/oder Globin-Transkriptdepletion.

Ja, sowohl die zytoplasmatische als auch die mitochondriale rRNA ist abgereichert.

Sowohl das KAPA RNA EvoPrep Kit mit RiboErase (HMR) als auch das KAPA RNA EvoPrep Kit mit RiboErase (HMR) Globin verwenden den gleichen Workflow und die gleichen Reagenzien, was eine Abreicherung von rRNA aus Menschen-, Maus- und Rattenspezies ermöglicht. Der einzige Unterschied besteht darin, dass während des anfänglichen Hybridisierungsschritts des Workflows ein zusätzliches Röhrchen mit Depletions-Oligos geliefert und zugegeben wird, um Globin-Transkripte bei Verwendung des KAPA RNA EvoPrep Kits mit RiboErase (HMR) Globin abzureichern. Diese globin-depletierenden Oligos zielen auf Globin-mRNA ab, die von Hämoglobin Alpha 1 (HGA1), Hämoglobin Alpha 2 (HGA2), Hämoglobin Beta (HGB) und Hämoglobin Gamma (HGG) abgeleitet ist.

• Fragmentierung durch Hitze und Magnesium;
• Synthese von cDNA des 1. Strangs mit zufälligem Priming;
• Kombinierte Synthese komplementärer DNA (cDNA) des 2. Strangs und A-Tailing, das den cDNA:RNA-Hybrid in doppelsträngige cDNA (dscDNA) umwandelt, Deoxyuridin-Triphosphatase (dUTP) in den zweiten cDNA-Strang integriert und Deoxyadenosin-Monophosphat (dAMP) an die 3′-Enden der dscDNA-Library-Fragmente fügt;
• Adapterligation, wobei dsDNA-Adapter mit 3′-dTMP-Überhängen an Library-Insert-Fragmente mit A-Tailing ligiert sind;
• Library-Amplifikation zur Amplifikation von Library-Fragmenten, die an beiden Enden geeignete Adaptersequenzen tragen, unter Verwendung von Polymerase-Kettenreaktionen (PCR) mit hoher Genauigkeit und geringem Bias. Der mit dUTP markierte Strang wird nicht amplifiziert, was eine strangspezifische Sequenzierung ermöglicht.

Das Voranreicherungsmodul für die mRNA-Erfassung nutzt magnetische Oligo-dT-Beads. Der rRNA- und/oder Globin-Abbau umfasst die Hybridisierung komplementärer DNA-Oligonukleotide, gefolgt von einer Behandlung mit Ribonuklease (RNase) H und Desoxyribonuklease (DNase), um rRNA- und/oder Globin-Transkripte zu entfernen, die an DNA- bzw. Original-DNA-Oligonukleotide gebunden sind.

In diesem Kit sind KAPA HyperPure Beads für Reaktionsreinigungsschritte enthalten. Es handelt sich um eine Suspension von paramagnetischen Perlpartikeln in einem Puffer, optimiert für die Aufreinigung bei Next-Generation-Sequencing und anderen molekularbiologischen Workflows. KAPA HyperPure Beads sind für manuelle Verarbeitung oder automatisierte Flüssigkeitshandhabung geeignet und ermöglichen eine effiziente Wiederfindung in beiden Formaten.

Ja, während der Synthese des 2. Strangs wird der cDNA:RNA-Hybrid in dscDNA umgewandelt, wobei dUTP in den zweiten cDNA-Strang integriert wird. Während der Library-Amplifikation wird der dUTP enthaltende Strang nicht amplifiziert, was eine strangspezifische Sequenzierung ermöglicht. Dieses Kit bewahrt bei ˃ 99 % der eindeutigen zugeordneten Lesevorgänge genaue Informationen zum Strangursprung auf.

Die Probenvorbereitung kann nach den Vordepletionsmodulen wie folgt sicher angehalten werden:

Nach der mRNA-Erfassung können die resuspendierten Perlen (in 22 μl Fragment-, Prime- und Elutionspuffer) ≤ 24 Stunden lang bei 4 °C gelagert werden.

Nach der rRNA- und/oder Globin-Depletion können die Proben nach der Elution in 1X Fragment-, Prime- und Elutionspuffer ≤ 24 Stunden bei -20 °C gelagert werden.

Der Library-Aufbau kann von RNA-Fragmentierung bis Library-Amplifikation in etwa 3,5 Stunden durchgeführt werden, abhängig von der Anzahl der zu verarbeitenden Proben und der Erfahrung der Mitarbeitenden. Das Protokoll kann bei Bedarf nach einem der folgenden Schritte sicher angehalten werden:

• Nach der Reinigung nach der Ligation kann die gereinigte, adapterligierte Library vor der Amplifikation 1 bis 2 Wochen lang bei +2 °C bis +8 °C oder ≤ 1 Monat lang bei -15 °C bis -25 °C gelagert werden. 
• Zur Abbauvermeidung sollte DNA stets in einer Pufferlösung (10 mM Tris-HCl, pH 8,0 – 8,5) aufbewahrt und Gefrier- und Auftauzyklen minimiert werden.

RNA wird bei hoher Temperatur in Anwesenheit von Magnesium fragmentiert. Je nach Herkunft und Integrität der Input-RNA und der beabsichtigten Anwendung werden verschiedene RNA-Fragmentierungsprotokolle bereitgestellt, um die erforderliche Insert-Größenverteilung zu erhalten. Bei intakter RNA, etwa aus frischem/gefrorenem Gewebe, ist eine längere Fragmentierung bei höheren Temperaturen erforderlich. Für abgebaute oder fragmentierte RNA (z. B. aus älteren Proben oder FFPE-Gewebe) sollte eine niedrigere Temperatur und/oder kürzere Zeit verwendet werden. Die Gebrauchsanweisungen der jeweiligen Produkte beschreiben verschiedene Fragmentierungsparameter in Abhängigkeit von Input-RNA und gewünschter Insert-Größe.

Im Vergleich zum KAPA RNA HyperPrep Kit und Kits anderer Anbieter erlaubt KAPA RNA EvoPrep eine verbesserte ribosomale RNA-Depletion. Dies ermöglicht konsistentere und zuverlässigere Leistung.¹

Die Ribodepletion wurde für das KAPA RNA EvoPrep Kit bei einer Reihe verschiedener Eingaben (5 ng, 25 ng und 100 ng) und bei FFPET-Proben von geringer Qualität verbessert (unsere Daten zeigen reduzierte rRNA-Anteile bei allen drei Eingaben für das KAPA RNA EvoPrep Kit mit RiboErase (HMR) im Vergleich zum KAPA RNA HyperPrep Kit mit RiboErase (HMR) und vier Kits anderer Anbieter).¹

Im Vergleich zum KAPA RNA HyperPrep Kit und den Kits anderer Anbieter bietet das KAPA RNA EvoPrep Kit ein verbessertes Strangverhalten, was zuverlässigere Erkenntnisse unterstützt. Dies gilt für eine Reihe von Eingaben (5 ng, 25 ng und 100 ng) und für FFPET-Proben von geringer Qualität.

Für die Verwendung mit den KAPA RNA EvoPrep Kits werden KAPA Unique Dual-Indexed Adapter in beiden Formaten empfohlen, trunkiert und in voller Länge. Diese Workflows sind jedoch auch mit anderen Adapterdesigns kompatibel, bei denen während des Ligationsschritts sowohl die Sequenzierungs- als auch die Clustergenerierungssequenzen hinzugefügt werden, wie sie routinemäßig in Illumina TruSeq, Agilent SureSelect XT2 und anderen ähnlichen Workflows zum Aufbau von Libraries verwendet werden. 

Es können auch kundenspezifische Adapter verwendet werden, die ein ähnliches Design aufweisen und mit der „TA-Ligation“ von dsDNA kompatibel sind, da kundenspezifische Adapterdesigns die Effizienz der Library-Konstruktion beeinträchtigen können. Trunkierte Adapterdesigns, bei denen Clustererzeugungssequenzen während der Amplifikation anstelle der Ligation hinzugefügt werden, erfordern möglicherweise modifizierte Reinigungsbedingungen nach der Ligation. Wenden Sie sich bei Fragen bezüglich der Adapterkompatibilität an uns. 

Weitere Informationen und Links zu KAPA-Adaptern mit eindeutigen Doppelindizes und KAPA Hyperplex Adaptern finden Sie auf der Website zu KAPA Adaptern, diese enthalten weitere Informationen zu Barcodesequenzen, Pooling, Kit-Konfigurationen, Formulierungen und zur Verdünnung für die verschiedenen KAPA RNA EvoPrep Kits und Eingaben. Weitere Informationen finden Sie in der entsprechenden Gebrauchsanweisung für KAPA RNA EvoPrep.

Gereinigte, adapterligierte cDNA kann vor der Amplifikation und/oder Sequenzierung eine Woche lang bei 4 °C oder mindestens einen Monat lang bei -20 °C gelagert werden. Zur Abbauvermeidung sollte DNA stets in einer Pufferlösung (10 mM Tris-HCl, pH 8,0) aufbewahrt und Gefrier- und Auftauzyklen minimiert werden.

KAPA HiFi HotStart DNA Polymerase ist das Enzym im KAPA EvoAmp ReadyMix des KAPA RNA EvoPrep Kits. Dies ist eine neuartige DNA-Polymerase der B-Familie, die für PCR mit geringem Bias und hoher Genauigkeit entwickelt wurde und das Reagenz der Wahl für die NGS-Library-Amplifikation ist.^{1, 2, 3, 4}

1. Oyola, S.O. et al. BMC Genomics 13, 1 (2012).
2. Quail, M.A. et al. Nature Methods 9, 10–11 (2012).
3. Quail, M.A. et al. BMC Genomics 13, 341 (2012).
4. Ross, M.G. et al. Genome Biology 14, R51 (2013).

Um die Überamplifikation und damit verbundene unerwünschte Artefakte zu minimieren, sollte die Anzahl der PCR-Zyklen den Anforderungen des Illumina-Geräts entsprechend optimiert werden, um eine ausreichende endgültige, amplifizierte Library für nachgelagerte Analysen und Qualitätskontrollen zu erzeugen. Für Zielerfassungs-Workflows ist typischerweise eine Library-Ausbeute von 1 µg erforderlich. Dies kann je nach verwendetem Verfahren und verwendeter Multiplexstrategie vor der Erfassung variieren.

Die in den Gebrauchsanweisung der jeweiligen KAPA RNA EvoPrep Kits empfohlene Anzahl von Zyklen sollte als Richtlinie für die Library-Amplifikation verwendet werden, wobei die Anzahl der Zyklen möglicherweise je nach gewünschter endgültiger Library-Ausbeute, Library-Amplifikationseffizienz, dem RNA-Fragmentierungsprofil und dem Vorhandensein von Adapterdimeren angepasst werden muss.

Die Größenverteilung der dscDNA und/oder der endgültigen amplifizierten Library sollte mit einer elektrophoretischen Methode bestätigt werden. Die Quantifizierung der Library sollte mit einem qPCR-basierten Quantifizierungskit wie dem KAPA Library Quantification Kit für Illumina-Plattformen durchgeführt werden. Bei diesem Kit kommen Primer zur Anwendung, die auf den Illumina-Fließzellen-Oligos basieren, und es kann zur Quantifizierung von Libraries verwendet werden, die für die Flowcell-Amplifiktion geeignet sind.

KAPA RNA EvoPrep Kits werden in mehreren Kartons geliefert.

• Die Komponenten für die cDNA-Synthese und die Library-Vorbereitung sind temperaturempfindlich und sollten nach Erhalt bei -15 °C bis -25 °C in einem Gefrierschrank mit konstanter Temperatur gelagert werden.
• Das Voranreicherungsmodul für die mRNA-Erfassung sollte nach Erhalt bei 2 °C bis 8 °C und das für die rRNA- und/oder Globin-Depletion bei -15 °C bis -25 °C gelagert werden.
• Bewahren Sie die KAPA HyperPure Beads bei 2 °C bis 8 °C auf.

Bei entsprechender Lagerung und korrekter Handhabung bleiben die Komponenten des Kits bis zum auf dem Etikett des Kits angegebenen Ablaufdatum vollständig aktiv.