Article

HIV Viral Load Monitoring

Zo werkt een COVID-19 test

Van materiaalafname bij de patiënt tot uitslag. Dit zijn de stappen in het moleculaire laboratorium bij het testen op het coronovirus

 

Moleculaire diagnostiek

 

Moleculaire diagnostiek omhelst de laboratoriumdiagnostiek waarbij gebruik wordt gemaakt van geavanceerde technieken om genetisch materiaal (DNA of RNA) van bijvoorbeeld mensen, dieren, planten en micro-organismen te onderzoeken. Op medisch microbiologische en moleculaire laboratoria wordt moleculaire diagnostiek toegepast om o.a. ziekteverwekkers zoals bacteriën, virussen en schimmels aan te tonen in diverse patiëntmaterialen.

Een veelvuldig gebruikte techniek om genetisch materiaal van bijvoorbeeld bacteriën en virussen aan te tonen, is de zogenaamde real-time PCR-reactie. Bij een real-time PCR-reactie wordt een specifiek stukje genetisch materiaal van een organisme dusdanig vaak vermenigvuldigd zodat het kan worden aangetoond. Voordat het genetisch materiaal echter kan worden vermenigvuldigd, dient het eerst uit de cellen vrijgemaakt te worden. Dit wordt de (nucleïnezuur)extractie genoemd. Bacteriën bevatten DNA als genetisch materiaal en de meeste virussen (waaronder het nieuwe coronavirus) bevatten RNA als genetisch materiaal.

Een Medisch Moleculair Microbioloog (MMM) heeft een universitaire opleiding gevolgd en is o.a. vakinhoudelijk verantwoordelijk voor de uitvoering van deze technieken op het laboratorium en de interpretatie van de resultaten. Hij of zij kan ervoor kiezen om deze testen zelf te ontwikkelen (een Lab Developed Test of LDT) of gebruik te maken van commercieel verkrijgbare testen. In Nederland wordt veel gebruik gemaakt van Lab Developed Tests.

collecting a sample
Hoe wordt SARS-CoV-2 aangetoond?

 

Stap 1: Afname van testmateriaal bij patiënten

Met een speciaal wattenstaafje (swab) wordt bij een         patiënt in de neusholte en/of keel testmateriaal afgenomen. Deze afname komt erg nauw en dient door getraind personeel volgens specifieke instructies te worden uitgevoerd. De swab wordt vervolgens in een buis met vloeistof geplaatst; het virustransportmedium. Na afname wordt de buis met patiëntmateriaal voorzien van een unieke (bar)code zodat duidelijk is welke buis bij welke patiënt behoort.

Het virustransportmedium zorgt ervoor dat de virusdeeltjes uit de swab in de vloeistof terechtkomen. In deze vloeistof kan het patiëntmateriaal tevens stabiel worden bewaard en getransporteerd wanneer het op de juiste temperatuur wordt opgeslagen.

Sommige laboratoria kiezen ervoor om het materiaal direct in lysisbuffer over te brengen in plaats van via het transportmedium.

 

Stap 2: Inactivatie van het virus

Op het laboratorium mogen de buizen met mogelijk besmet patiëntmateriaal pas worden geopend op een speciale, veilige werkplek; in een zogenaamde LAF-kast. Deze werkplek zorgt ervoor dat het laboratoriumpersoneel geen virusdeeltjes kan inademen als deze zouden vrijkomen tijdens het openen van de buizen.

In de LAF-kast wordt lysisbuffer aan de afgenomen materialen toegevoegd - indien dit nog niet eerder is gebeurd. Deze lysisbuffer zorgt ervoor dat het virus wordt geïnactiveerd en daarmee niet meer besmettelijk is voor de analist. Daarna kunnen de patiëntmaterialen veilig op het laboratorium worden verwerkt. De hierboven beschreven procedure kan van lab tot lab iets verschillen.

 

Stap 3: Extractie van het genetisch materiaal

Er zijn verschillende methodes om genetisch materiaal uit patiëntmateriaal te verkrijgen. De geavanceerde testsystemen van Roche draaien met een techniek waarbij gebruik wordt gemaakt van kleine magnetische, met een glaslaagje omhulde bolletjes (< 1/1000e van een millimeter): Magnetic Glass Particles (MGP’s) genoemd. Het proces om genetisch materiaal uit patiëntmateriaal te verkrijgen, kent uit de volgende stappen:

·         Lysisstap: de celwanden van de humane cellen, bacteriën en virussen die zich in het patiëntmateriaal bevinden, worden kapot gemaakt door het toevoegen van lysisbuffer, enzymen en het verhogen van de reactietemperatuur. Het genetisch materiaal dat zich in de cellen bevindt, komt hierdoor vrij in de vloeistof.

·         Bindingsstap: MGP’s worden toegevoegd aan het patiëntmateriaal. Onder de juiste (chemische) omstandigheden bindt het vrijgekomen genetische materiaal aan deze MGP’s.

·         Wasstap: door een magneet tegen het reactievaatje aan te houden, worden de MGP’s, met daaraan gebonden het genetisch materiaal, vastgehouden. Vervolgens wordt de resterende vloeistof verwijderd en wordt er enkele malen een nieuwe wasvloeistof aan het reactievaatje toegevoegd. Dit zorgt ervoor dat alle mogelijke verontreinigingen worden verwijderd en zuiver genetisch testmateriaal overblijft.

·         Elutiestap: na het wassen wordt de temperatuur in het reactievaatje verhoogd en onder de juiste (chemische) omstandigheden laat het genetisch materiaal weer los van de MGP’s. De resterende vloeistof met daarin het gezuiverde genetisch materiaal wordt vervolgens gebruikt voor de volgende stap van het proces: de real-time PCR-reactie. Opmerking: dit gezuiverde genetisch materiaal bestaat uit materiaal uit alle cellen die aanwezig waren in het patiëntmateriaal. Dat kan genetisch materiaal van de patiënt zelf zijn, maar ook genetisch materiaal van bijvoorbeeld virussen en bacteriën.

 

 

 

What is viral load and what does it mean?

 

Viral load is the amount of HIV circulating in the blood stream. The goal of ART is viral load suppression to the extent that it is brought to and maintained at undetectable levels.


A low viral load indicates that the treatment is working and is effective. A high viral load, on the other hand, suggests that the virus is becoming resistant to therapy or that the treatment is not being followed rigorously.

Research has shown that HIV can persist after years of aggressive drug treatment and can hide in the gut tissue.2 But at a very low level the virus can neither harm the patient nor infect others.

Ideally the therapy should achieve an undetectable viral load. In order to measure viral loads, we need diagnostic assays that have high sensitivity.

HIV-Virus-High-Low-Indet-Image