SYBR Green I - флуоресцентный краситель, который связывается только с двунитевой ДНК. Он встраивается в малую бороздку ДНК, что сопровождается резким ростом его флуоресценции. Во время ПЦР интенсивность флуоресцентного сигнала от SYBR Green, измеряемая в конце каждого этапа элонгации, указывает на количество ПЦР-продукта, синтезированного к данному циклу.
Зонды, комплементарные к определенным нуклеотидным последовательностям, обеспечивают высокоспецифичную детекцию последовательностей-мишеней в режиме реального времени. Этот метод позволяет выявить даже единичные копии искомой последовательности в сложных матрицах, например, в геномной ДНК. Поэтому такой формат детекции является приоритетным для молекулярной диагностики.
Существует несколько типов анализа, в которых применяются специфичные зонды. Два типа зондов - гибридизационные и гидролизные - используются в диагностике наиболее часто. Применение обоих типов зондов основано на явлении резонансного переноса флуоресцентной энергии (FRET).
Гибридизационный зонд - это два олигонуклеотида, меченные разными флуоресцентными красителями, один – донорным, другой - акцепторным. Донорный краситель, возбуждаемый внешним источником света, испускает сигнал, который, в свою очередь, возбуждает свечение акцепторного красителя, но только в том случае, когда оба красителя находятся близко друг к другу и между ними возможен перенос энергии (FRET). Последовательности зондов подобраны именно так, чтобы они гибридизовались с ДНК-мишенью в непосредственной близости друг от друга. Измерение флуоресцентного сигнала акцепторного красителя производится на этапе отжига зондов, и интенсивность сигнала прямо пропорциональна числу копий амплифицированной мишени.
Гидролизный зонд – это один олигонуклеотид, который несет два флуоресцентных красителя, называемые репортер и гаситель. В условиях непосредственной близости красителей свечение репортера, возбуждаемое внешним источником света, поглощается гасителем за счет механизма FRET. При разъединении обоих флуорофоров генерируется флуоресцентный сигнал. Когда зонд находится в свободном состоянии, оба красителя расположены близко друг к другу, поэтому происходит гашение флуоресценции. В ходе ПЦР, на этапе удлинения цепи гибридизовавшийся зонд расщепляется полимеразой, которая обладает 5’-экзонуклеазной активностью, красители разъединяются, и наблюдается флуоресцентный сигнал, пропорциональный количеству амплифицированного продукта. При таком анализе измерение сигнала происходит на этапе элонгации.
