Vyšetřování agregace krevních destiček na přístroji Multiplate^®

MUDr. Lenka Bultasová Ústav klinické biochemie a hematologie, Lékařská fakulta v Plzni, Univerzita Karlova a Fakultní nemocnice Plzeň

Ing. Martin Pulcer, Ph.D., MBA Oddělení klinické hematologie, Ústav laboratorní medicíny, Fakultní nemocnice Ostrava, Ústav laboratorní medicíny, Lékařská fakulta, Ostravská univerzita

ÚVOD

Fakultní nemocnice Plzeň a Fakultní nemocnice Ostrava patří mezi pracoviště s dlouholetou tradicí vyšetřování funkce krevních destiček a sledování účinnosti protidestičkové léčby. K tomuto účelu lze použít různé laboratorní přístroje od samostatných poloautomatických agregometrů až po plně automatizované kombinované koagulometry/agregometry. Cílem tohoto sdělení je podat ucelený přehled o problematice vyšetřování funkce trombocytů a účinnosti protidestičkové léčby na impedančním agregometru Multiplate®. V článku najdete komplexní informace od zhodnocení obecných podmínek preanalytické fáze, včetně odběru krevního vzorku, přes jednotlivá specifika laboratorního vyšetření až po stabilitu vzorku a nastavení systému kontroly kvality.

KREVNÍ DESTIČKY A MOŽNOSTI VYŠETŘOVÁNÍ JEJICH FUNKCE

Krevní destičky neboli trombocyty jsou bezjaderné krevní elementy. Jejich fyziologický počet se u dospělých mužů i žen pohybuje v rozmezí 150–400 x 109/l.^{1, 2} Jsou klíčové pro primární hemostázu, hrají stěžejní roli v procesu arteriální trombózy a významné místo mají i v sekundární hemostáze, kde poskytují fosfolipidové povrchy pro správný průběh tvorby fibrinového vlákna. Neopomenutelná je také jejich funkce v procesu zánětu a jejich fagocytární aktivita.

Pro organismus je důležitý nejen jejich počet, ale především správná funkce.^{1, 3} Stanovení počtu trombocytů je součástí běžného vyšetření krevního obrazu⁴ a provádí ho všechny typy hematologických laboratoří. Vyšetření funkce krevních destiček patří mezi specializovanější vyšetření soustředěná na určitá laboratorní pracoviště. Součástí laboratorních výsledků bývá i celkové hodnocení a komentář hematologa.

Pro diagnostiku správné funkce destiček a účinnosti protidestičkové léčby jsou dostupné metody založené na různých principech detekce:

• optická transmisní agregometrie (LTA, z angl. Light Transmission Aggregometry),

• impedanční agregometrie (WBA, z angl. Whole Blood Aggregometry) (Multiplate, ROTEM Platelet),

• průtoková cytometrie,

• analyzátory PFA-100, PFA-200,

• Total Thrombus-formation Analysis System (T-TAS),

• viskoelastické metody (ROTEM, TEG, TEG 6S PlateletMapping).

Na trhu je celá řada přístrojů od různých výrobců. Mezi nejčastěji používané přístroje v hematologických laboratořích patří agregometry pracující na principu světelné transmisní agregometrie (APACT 4004, VerifyNow, Thrombomate XRA) a impedanční agregometrie (Multiplate®), viz Obr. 1 a 2.^{4, 5} Dalším typem analýzy destičkových funkcí je přístroj PFA-100/ PFA-200, který hodnotí funkci dvou složek primární hemostázy zároveň – funkci trombocytů a von Willebrandova faktoru. V rámci urgentní medicíny jsou využívány viskoelastické POCT metody (ROTEM, ROTEM Platelet, TEG) posuzující komplexně proces tvorby a stability koagula. V protikladu k těmto POCT přístrojům a samostatným agregometrům jsou kapacitní plně automatické koagulační analyzátory, které umožňují vedle koagulačních para- metrů vyšetřit i funkci krevních destiček (např. od výrobců Sysmex, Siemens).

Léky ovlivňující funkci trombocytů (nutno vysadit 10 dní před vyšetřením funkce trombocytů):

• protidestičkové léky (např. Dipyridamol, Clopidogrel, Prasugrel),

• léky obsahující kyselinu acetylsalicylovou (např. Anopyrin, Aspirin, Godasal),

• léky proti bolestem kloubů (např. Ibuprofen, Ibalgin, Diclofenac, Voltaren),

• mukolytika (např. Acetylcystein).

Dále existují léky, které mohou ovlivnit funkci trombocytů:

• antibiotika (peniciliny, cefalosporiny, nitrofurantoin),

• betablokátory, blokátory kalciového kanálu, ACE-inhibitory,

• statiny,

• hepariny (UFH i LMWH),

• tricyklická antidepresiva, SSRI.

Funkci trombocytů ovlivňuje i strava, např. ryby (omega-3 mastné kyseliny), česnek, cibule nebo výtažky z Ginkgo biloba.^{8, 10}

Pro vyšetření funkce krevních destiček na přístroji Multiplate® se doporučuje provádět odběr žilní krve do zkumavek obsahujících antikoagulant hirudin o koncentraci 25 μg/l. V současnosti se nedoporučuje náběr do citrátu sodného. Důvodem je deplece (vyčerpání) vápníku ve vzorku žilní krve.¹¹ Vzorky hirudinové krve je vhodné transportovat do laboratoře donáškou. Teplota by se měla udržovat v rozmezí 15–25 °C. Standardně není doporučován transport potrubní poštou z důvodu možné aktivace destiček. V případě novějších typů potrubní pošty je možné její použití po předchozí validaci transportu. 

Vzorky hirudinové krve se doporučuje vyšetřit v rozmezí 0,5 až 3 hodiny po provedení odběru. Zároveň s odběrem krve na vyšetření funkce trombocytů je vždy nutné odebrat vzorek na vyšetření počtu trombocytů do K3EDTA. Metoda je citlivá na patologické počty trombocytů ve vyšetřované krvi a výsledek vyšetření je tak nutné interpretovat s ohledem na počty trombocytů. Indikující lékař musí vždy informovat laboratoř o případné podávané protidestičkové léčbě pacienta a účelu vyšetření.^{8, 12}

Mezi nejčastější chyby preanalytické fáze při vyšetřování na přístroji Multiplate® patří:

• chybějící informace o léčbě, která ovlivňuje funkci krevních destiček,
• odběr do zkumavky s nevhodným antikoagulantem,
• nedostatečné promíchání vzorku s antikoagulantem (riziko vzniku mikrotrombů),
• použití nevhodného průměru jehly při odběru – příliš tenká jehla (aktivace trombocytů),
• skladování a doprava primárního vzorku krve mimo teplotní rozmezí 15–25 °C, nešetrný transport (možná aktivace krevních destiček).

FYZIOLOGIE AGREGACE TROMBOCYTŮ

Na počátku procesu agregace krevních destiček je jejich aktivace. Ta je vyvolána prostřednictvím receptorů na jejich povrchu. Mezi nejznámější a nejdůležitější receptory patří adhezivní komplex GP Ib/V/ IX (vazba na trombin a von Willebrandův faktor), dále GP Ia/IIa a GP VI (vazba na kolagen), receptory pro ADP (P2Y1 a P2Y12) a trombinové receptory (PAR1 a PAR4). V aktivované destičce následně probíhá dlouhá řada metabolických procesů. Některé z nich vedou k uvolnění kyseliny arachidonové z membrány destičky a následné tvorbě tromboxanu A2 (TxA2), jiné k uvolnění ADP z denzních granulí. TxA2 a ADP aktivují zpětnovazebně krevní destičku, ze které byly uvolněny, a ovlivňují také okolní destičky. Zásadní změny postihují receptory GP IIb/IIIa – dochází k jejich konfirmačním změnám a významnému zvýšení jejich počtu v povrchové membráně trombocytu. Úkolem GP IIb/ IIIa je pomocí fibrinogenových můstků či můstků vWF důkladně „slepit“ trombocyty dohromady a docílit ireverzibilní agregace trombocytů. Důležitou součástí procesu agregace jsou morfologické změny tvaru destiček (tvorba pseudopodií, zvětšení jejich povrchu) a změny v uspořádání membrán, tzv. flip-flop fenomén, díky němuž se negativně nabité fosfolipidy, které jsou významné pro tvorbu enzymatických komplexů koagulačních faktorů (vnitřní a zevní tenáza, protrombináza) v procesu sekundární hemostázy, dostávají z vnitřní na zevní stranu membrány trombocytů.

PROTIDESTIČKOVÁ LÉČBA

Protidestičková léčba je základem léčby kardiovaskulárních chorob, které patří v rozvinutých zemích celého světa k nejčastějším příčinám morbidity a mortality. Do skupiny těchto chorob patří např. ischemická choroba srdeční, cévní mozková příhoda a ischemická choroba dolních končetin.

Nejstarším protidestičkovým lékem je kyselina acetylsalicylová (Aspirin, Anopyrin, Godasal, Stacyl). Její účinek je založen na ireverzibilní inhibici cyklooxygenázy 1 (COX-1) krevních destiček. COX-1 katalyzuje transformaci kyseliny arachidonové (která se uvolňuje z buněčné membrány trombocytů při jejich aktivaci) na prostaglandin H2, který je dále metabolizován tromboxan-syntetázou na TxA2. TxA2 je jedním z hlavních induktorů agregace krevních destiček. Vzhledem k tomu, že bezjaderné trombocyty nemohou syntetizovat novou COX-1, je účinek kyseliny acetylsalicylové nezvratný a trvá po celou dobu životnosti destičky.

Clopidogrel je dlouho používaný lék ze skupiny blokátorů ADP receptorů P2Y12. Jedná se o proléčivo, které vyžaduje pro svoji přeměnu na aktivní metabolit hned několik enzymů. Tato přeměna může být ovlivněna některými faktory, jako jsou genetický polymorfismus nebo interakce s jinými léčivy, a jeho účinek tím může být snížen nebo zvýšen.¹³ Z tohoto důvodu byly vyvinuty nové blokátory ADP receptorů P2Y12, např. tikagrelor, prasugrel. Tyto léky mají vyšší účinnost, ale také vyšší riziko krvácivých komplikací, a proto např. prasugrel je z tohoto důvodu u pacientů s cévní mozkovou příhodou dokonce kontraindikován.

Speciální kategorií léků jsou blokátory GP IIb/IIIa, mezi které patří eptifibatid a tirofiban. Jsou to léky s krátkým biologickým poločasem, které se podávají intravenózně v určených indikacích v souvislosti s implantací stentů do ateroskleroticky postižených tepen.

TESTY POUŽÍVANÉ NA PŘÍSTROJI MULTIPLATE

Mezi nejčastěji používané testy patří ADPtest, ADPtest HS, ASPItest a TRAPtest, jak je ukázáno na Obr. 4 a v Tab. 1. Každý test má svůj specifický princip a hodnotí funkčnost určité cesty procesu aktivace a agregace trombocytů. Níže budou probrány čtyři nejčastěji používané testy detailněji.¹⁴

ADPtest/ADPtest HS

Induktor ADP působí prostřednictvím ADP receptorů (P2Y1 a P2Y12). Vedle základního ADPtestu se používá i jeho modifikovaná verze, tzv. ADPtest HS (high sensitivity15 s přidáním prostaglandinu E1 (PGE1). PGE1 zvyšuje koncentrace cAMP stimulací aktivity adenylátcyklázy v destičkách. Nárůst cAMP inhibuje mobilizaci vápníku a agregaci destiček vyvolanou aktivací receptoru P2Y1. Přidání PGE1 do vzorku krve snižuje aktivaci destiček přes receptor P2Y1 způsobem závislým na koncentraci a tím vyvolá citlivější vyhodnocení účinku látek, které mají vliv na agregaci destiček prostřednictvím vazby na receptor P2Y12. Přidání 20 μl PGE1 do ADPtestu vyvolá mírnou inhibici aktivace destiček ve zdravých normálních vzorcích krve, ale výrazný nárůst citlivosti testu na inhibici destiček vyvolanou podáváním blokátorů P2Y12. Jelikož k agregaci destiček dochází prostřednictvím vazby mezi destičkami a fibrinogenem na receptorových místech glykoproteinu (GP) IIb/IIIa, může být v tomto testu agregace destiček snížená nebo chybět v přítomnosti antagonistů receptoru GPIIb/IIIa nebo při deficitu těchto receptorů, jako např. u vrozené Glanzmannovy trombastenie.

^{Obr. 4: Schéma vlivu induktorů na stanovení funkce destiček (upraveno dle https://diagnostics.roche.com/cz/cs/products/instruments/multiplate-6-analyzer.html#productInfo)}

ASPItest

Reagencií používanou v ASPItestu je kyselina arachidonová.¹² Sama o sobě neaktivuje krevní destičky, ale prostřednictvím enzymu cyklooxygenázy (COX-1) se mění na tromboxan A2, který je silným proagregačním činidlem. Tím se tato metoda stává ideální pro stanovení míry aktivity COX-1 v trombocytech. Je-li aktivita COX-1 inhibována kyselinou acetylsalicylovou nebo jinými nesteroidními antirevmatiky, výsledná agregace bude slabší nebo k ní nedojde. Nízká dávka kyseliny acetylsalicylové postačuje k tomu, aby trvale zablokovala COX-1 a potlačila více než 95 % produkce tromboxanu. Vzhledem k tomu, že destičky nemají metabolický aparát k obnově funkce COX-1, zůstává agregace destiček inhibována po celou dobu jejich života. Obnova aktivity cyklooxygenázy v krvi u zdravých jedinců je přibližně 10 % a je dána produkcí nové generace destiček kostní dření. I při podávání kyseliny acetylsalicylové však mohou destičky agregovat za přítomnosti silných antagonistů destiček, jakými jsou kolagen a trombin. I zde, stejně jako u předchozího testu, může být agregace trombocytů snížená, nebo může chybět v přítomnosti antagonistů receptoru GPIIb/IIIa nebo u vrozené Glanzmannovy trombastenie.

TRAPtest

TRAPtest umožňuje zhodnotit schopnost agregace trombocytů prostřednictvím aktivace proteázami aktivovaného receptoru 1 a 4 (PAR1a PAR4) – trombinových receptorů. Aktivace receptoru vede k přímé agregaci destiček cestou vazby fibrinogenu na glykoproteinové receptory IIb/IIIa (GpIIb/IIIa) na membráně destiček. Látkou, která je v testu používána k aktivaci PAR1 receptoru, je TRAP-6 (peptid aktivující trombinový receptor). Jedná se o silný aktivátor destiček¹⁶ a umožňuje testovat funkce destiček aktivovaných PAR1 receptorem bez spuštění tvorby fibrinu ve vzorku, k čemuž by došlo, pokud by byl jako agonista použit trombin.

Agregace destiček vyvolaná TRAP-6 může být omezená nebo chybějící v přítomnosti PAR1 inhibitoru (Vorapaxar) a opět také v přítomnosti antagonistů GpIIb/IIIa3 nebo při vrozeném deficitu GpIIb/IIIa receptorů (Glanzmannova trombastenie). Agregace indukovaná TRAP-6 je mírně citlivá na inhibici kyselinou acetylsalicylovou nebo antagonisty ADP receptoru.

OMEZENÍ A INTERFERENCE

Výsledky vyšetření funkce trombocytů interferují s počtem trombocytů ve vyšetřované krvi a mohou být abnormální u pacientů s trombocytopenií, nebo naopak trombocytózou.

Snížená funkce destiček byla popsána po požití různých léků a bylinných přípravků, při stravě obsahující některé mastné kyseliny (omega-3). Je proto nutné sledovat informace na příbalových letácích jednotlivých testů.^{8, 15, 12, 16}

KONTROLA KVALITY

Měření dvěma dvojicemi elektrod zároveň, tedy v duplicitě, umožňuje kontrolu měření probíhajícího testu a stanovení dvou specifických a současně nezávislých parametrů:

•  odchylka od průměru (tzv. Deviation from the mean – DIF): maximálně 20,00 %,

•  korelační koeficient (tzv. Correlation coefficient – CC): minimálně 0,980.

•  Při překročení hraničních hodnot (DIF, CC) hlásí přístroj obsluze, že výsledek není validní, a je nutné vyšetření opakovat.¹⁷

•  Správnost probíhající změny elektrického proudu lze testovat pomocí umělého kontrolního materiálu, tzv. Liquid Control Set. Sada Liquid Control Set (LQC) se skládá ze 2 kapalin, Solution 1 a Solution 2, s různými iontovými silami. Každý z roztoků způsobí změnu elektrické vodivosti, která se má pohybovat v předem určeném referenčním rozmezí.¹⁸

•  Další z možností kontroly kvality je vyšetření plné krve dárce s přídavkem reagencie GpIIb/IIIa Antagonist Reagent. Tato reagencie obsahuje syntetický inhibitor receptoru GpIIb/IIIa krevních destiček (molekulová hmotnost 495 g/mol při koncentraci 50 μg/ml) inhibujících agregaci trombocytů. Test slouží jako patologická kontrola.¹⁹

•  V případě, že laboratoř vlastní dva či více přístrojů Multiplate®, lze do systému interní kontroly kvality zavést mezipřístrojové porovnání s proměřením například fyziologického vzorku krve zdravého dárce, popř. patologického vzorku pacienta, a vypočítat odchylku měření.²⁰

•  Externí hodnocení kvality (EHK) pro metody vyšetření funkce trombocytů není zatím k dispozici u žádného poskytovatele EHK.

HISTORIE A SOUČASNOST VYŠETŘOVÁNÍ AGREGACÍ KREVNÍCH DESTIČEK NA PŘÍSTROJI MULTIPLATE® VE FN PLZEŇ

Vyšetření agregace trombocytů má ve FN Plzeň dlouholetou tradici. Rodina agregometrů zde byla rozšířena o první impedanční agregometr Multiplate® již v roce 2010.

Ve FN Plzeň je relativně vysoká poptávka po vyšetření funkcí trombocytů za účelem kontroly účinnosti protidestičkové léčby. K vyšetření jsou dvě základní indikace.

Jednak kontrola dosažení dostatečné účinnosti u pacientů léčených pro ischemickou chorobu srdeční, stavů po mozkových příhodách, nebo před/po implantaci arteriálních stentů. Druhou je pak naopak ověření odeznění účinku protidestičkových léků před plánovanými, ale i akutními operacemi, především neurochirurgickými. Uživatelsky jednoduchá obsluha analyzátoru umožňuje provádět vyšetření v rámci denní i odpolední směny každý den včetně víkendů a svátků.

Kromě rutinních vyšetření vzorků pacientů je analyzátor využíván i pro účely vědeckých studií.²¹

Laboratoř stanovila za rok 2022 necelých tisíc vyšetření, což znamená bez ohledu na víkendy a svátky průměrně dvě až tři vyšetření denně. Nejčastěji jsou prováděny metody ASPItest a ADPtest HS. Přestože je v laboratoři zaveden TRAPtest, požadavky na jeho vyšetření jsou poměrně vzácné (6 vyšetření za rok 2022).

V souladu s léčebnými doporučeními odborných společností pro prevenci aterotrombotických příhod patří mezi nejčastěji podávanou, a tedy i kontrolovanou, protidestičkovou léčbu kyselina acetylsalicylová (ASPItest). Poměrně překvapivé je, že přední místo v žebříčku počtu indikovaných vyšetření protidestičkové léčby obsadilo dle statistického zhodnocení Neurochirurgické oddělení. Počtem indikací ho převyšuje pouze Neurologická klinika a pacienti Kardiologické kliniky stojí až na třetím místě. Pokud se podíváme na statistiku četnosti požadavků na kontrolu protidestičkové léčby blokátory ADP receptorů, pak byla nejčastěji indikována opět lékaři Neurologické kliniky.

TRAPtest

TRAPtest umožňuje zhodnotit schopnost agregace trombocytů prostřednictvím aktivace proteázami aktivovaného receptoru 1 a 4 (PAR1a PAR4) – trombinových receptorů. Aktivace receptoru vede k přímé agregaci destiček cestou vazby fibrinogenu na glykoproteinové receptory IIb/IIIa (GpIIb/IIIa) na membráně destiček. Látkou, která je v testu používána k aktivaci PAR1 receptoru, je TRAP-6 (peptid aktivující trombinový receptor). Jedná se o silný aktivátor destiček16 a umožňuje testovat funkce destiček aktivovaných PAR1 receptorem bez spuštění tvorby fibrinu ve vzorku, k čemuž by došlo, pokud by byl jako agonista použit trombin.

Agregace destiček vyvolaná TRAP-6 může být omezená nebo chybějící v přítomnosti PAR1 inhibitoru (Vorapaxar) a opět také v přítomnosti antagonistů GpIIb/IIIa3 nebo při vrozeném deficitu GpIIb/IIIa receptorů (Glanzmannova trombastenie). Agregace indukovaná TRAP-6 je mírně citlivá na inhibici kyselinou acetylsalicylovou nebo antagonisty ADP receptoru.

OMEZENÍ A INTERFERENCE

Výsledky vyšetření funkce trombocytů interferují s počtem trombocytů ve vyšetřované krvi a mohou být abnormální u pacientů s trombocytopenií, nebo naopak trombocytózou.

Snížená funkce destiček byla popsána po požití různých léků a bylinných přípravků, při stravě obsahující některé mastné kyseliny (omega-3). Je proto nutné sledovat informace na příbalových letácích jednotlivých testů.^{8, 15, 12, 16}

KONTROLA KVALITY

Měření dvěma dvojicemi elektrod zároveň, tedy v duplicitě, umožňuje kontrolu měření probíhajícího testu a stanovení dvou specifických a současně nezávislých parametrů:

•  odchylka od průměru (tzv. Deviation from the mean – DIF): maximálně 20,00 %,

•  korelační koeficient (tzv. Correlation coefficient – CC): minimálně 0,980.

•  Při překročení hraničních hodnot (DIF, CC) hlásí přístroj obsluze, že výsledek není validní, a je nutné vyšetření opakovat.¹⁷

•  Správnost probíhající změny elektrického proudu lze testovat pomocí umělého kontrolního materiálu, tzv. Liquid Control Set. Sada Liquid Control Set (LQC) se skládá ze 2 kapalin, Solution 1 a Solution 2, s různými iontovými silami. Každý z roztoků způsobí změnu elektrické vodivosti, která se má pohybovat v předem určeném referenčním rozmezí.¹⁸

•  Další z možností kontroly kvality je vyšetření plné krve dárce s přídavkem reagencie GpIIb/IIIa Antagonist Reagent. Tato reagencie obsahuje syntetický inhibitor receptoru GpIIb/IIIa krevních destiček (molekulová hmotnost 495 g/mol při koncentraci 50 μg/ml) inhibujících agregaci trombocytů. Test slouží jako patologická kontrola.¹⁹

•  V případě, že laboratoř vlastní dva či více přístrojů Multiplate®, lze do systému interní kontroly kvality zavést mezipřístrojové porovnání s proměřením například fyziologického vzorku krve zdravého dárce, popř. patologického vzorku pacienta, a vypočítat odchylku měření.²⁰

•  Externí hodnocení kvality (EHK) pro metody vyšetření funkce trombocytů není zatím k dispozici u žádného poskytovatele EHK.

HISTORIE A SOUČASNOST VYŠETŘOVÁNÍ AGREGACÍ KREVNÍCH DESTIČEK NA PŘÍSTROJI MULTIPLATE® VE FN PLZEŇ

Vyšetření agregace trombocytů má ve FN Plzeň dlouholetou tradici. Rodina agregometrů zde byla rozšířena o první impedanční agregometr Multiplate® již v roce 2010.

Ve FN Plzeň je relativně vysoká poptávka po vyšetření funkcí trombocytů za účelem kontroly účinnosti protidestičkové léčby. K vyšetření jsou dvě základní indikace.

Jednak kontrola dosažení dostatečné účinnosti u pacientů léčených pro ischemickou chorobu srdeční, stavů po mozkových příhodách, nebo před/po implantaci arteriálních stentů. Druhou je pak naopak ověření odeznění účinku protidestičkových léků před plánovanými, ale i akutními operacemi, především neurochirurgickými. Uživatelsky jednoduchá obsluha analyzátoru umožňuje provádět vyšetření v rámci denní i odpolední směny každý den včetně víkendů a svátků.

Kromě rutinních vyšetření vzorků pacientů je analyzátor využíván i pro účely vědeckých studií.²¹

Laboratoř stanovila za rok 2022 necelých tisíc vyšetření, což znamená bez ohledu na víkendy a svátky průměrně dvě až tři vyšetření denně. Nejčastěji jsou prováděny metody ASPItest a ADPtest HS. Přestože je v laboratoři zaveden TRAPtest, požadavky na jeho vyšetření jsou poměrně vzácné (6 vyšetření za rok 2022).

V souladu s léčebnými doporučeními odborných společností pro prevenci aterotrombotických příhod patří mezi nejčastěji podávanou, a tedy i kontrolovanou, protidestičkovou léčbu kyselina acetylsalicylová (ASPItest). Poměrně překvapivé je, že přední místo v žebříčku počtu indikovaných vyšetření protidestičkové léčby obsadilo dle statistického zhodnocení Neurochirurgické oddělení. Počtem indikací ho převyšuje pouze Neurologická klinika a pacienti Kardiologické kliniky stojí až na třetím místě. Pokud se podíváme na statistiku četnosti požadavků na kontrolu protidestičkové léčby blokátory ADP receptorů, pak byla nejčastěji indikována opět lékaři Neurologické kliniky.

VYBRANÁ KAZUISTIKA

Pacient XY, narozený v r. 1972, který prodělal již ve svých 48 letech ischemickou cévní mozkovou příhodu a byl léčen protidestičkovou léčbou kyselinou acetylsalicylovou (ASA) v dávce 100 mg p.o., byl dne 18. 5. 2022 přijat na Kardiologickou kliniku FN Plzeň pro akutní infarkt myokardu v oblasti spodní stěny. Byla provedena koronarografie a angioplastika těsné stenózy arteria coronaria dextra a implantován stent. Pacient měl i nadále sklon k hypotenzi a bradykardii. Vzhledem k příhodě vzniklé při protidestičkové léčbě ASA bylo vysloveno podezření na rezistenci k této léčbě. Vyšetření funkce trombocytů na přístroji Multiplate® skutečně potvrdilo zcela neúčinnou terapii ASA (viz Tab. 2, Obr. 7). Ke stávající medikaci byl přidán ticagrelor (Brillique 90 mg 1 tbl. 2x denně). Dne 25. 5. 2022 byla provedena kontrola účinnosti duální protidestičkové terapie a byla shledána neúčinnou. Pacient měl v anamnéze úraz pravé dolní končetiny a pro přetrvávající bolest a otok pravého bérce byla dne 24. 5. 2022 provedena DUSG (Dopplerovská ultrasonografie) s nálezem prokrvácení lýtkového svalu. Vzhledem k vysoké rizikovosti polohy implantovaného stentu a ohrožení života pacienta v případě jeho trombotizace a zároveň přítomnosti krvácení do svalu bylo požadováno hematologické konzilium. K vyloučení rezistence k ASA bylo doporučeno podat nasycovací dávku 500 mg ASA i.v. (Cardegic 500 mg) a provedení kontroly účinnosti druhý den po podání. Kontrolní vyšetření funkce trombocytů prokázalo již plně účinnou léčbu ticagrelorem a hodnotu ASPItestu, která nesvědčila pro rezistenci k léčbě ASA. Pokračující léčba ASA byla doporučena v dávce 300 mg p.o. denně. V krevním obraze byla reaktivní trombocytóza (trombocyty 520 x 109/l). Vyšetření funkce trombocytů dne 27. 5. 2022 (viz Tab. 2) prokázalo vysokou účinnost duální protidestičkové léčby i při přetrvávající trombocytóze (trombocyty 521 x 109/l) a umožnilo snížení udržovací dávky ASA na 100 mg p.o. denně. Výsledky dalšího kontrolního vyšetření ze dne 30. 5. 2022 již ukazují na adekvátně nastavenou duální protidestičkovou terapii. Vzhledem k přetrvávající trombocytóze (trombocyty 566 x 109/l) byl pacient po propuštění pozván ke kontrolnímu vyšetření s myšlenkou možného nežádoucího vzestupu účinnosti protidestičkové terapie po normalizaci počtu trombocytů. Toto opravdu potvrdilo vyšetření ze dne 2. 6. 2022 (viz Tab. 2) a dávka přípravku Brilique byla následně redukována.

Během hospitalizace a nastavování účinné duální protidestičkové léčby nedošlo k progresi krvácení do lýtkového svalu a v období po propuštění do ambulantní péče došlo k jeho bezproblémovému zhojení. Pacient je do doby předání tohoto článku k tisku bez recidivy infarktu myokardu.

^{Obr. 7: Výsledkové listy vyšetření funkce trombocytů (vlastní data)}

Závěr

Vedle optické agregometrie je možné vyšetřovat funkci trombocytů a sledovat účinnost protidestičkové léčby impedančním principem na přístroji Multiplate®.

Velkým přínosem oproti metodám optické agregometrie je vyšetření z plné krve, které vede k úspoře času a menší pracovní zátěži pro pracovníky laboratoří a zároveň stav vyšetřovaného vzorku více odpovídá podmínkám v organismu (přítomnost všech složek krve, neupravovaný vzorek krve).

Přístroj lze používat jak v centrálních hematologických laboratořích, tak vzhledem k nenáročné obsluze i v režimu POCT na klinických odděleních.

Pro vyšetření funkce krevních destiček na přístroji Multiplate® se doporučuje provádět odběr žilní krve pouze do zkumavek s hirudinem o koncentraci 25 μg/l. Vzorky by měly být vyšetřeny v rozmezí 0,5 až 3 hodiny po provedení odběru.

Vedle hirudinové zkumavky je vždy nutné odebrat vzorek krve do K3EDTA a provést vyšetření krevního obrazu ke zjištění počtu trombocytů.

Mezi nejčastěji používané testy patří ADPtest/ADPtest HS, ASPItest a TRAPtest. Každý test má svůj specifický princip, hodnotí funkčnost určité cesty procesu aktivace a agregace trombocytů a má svou klinickou indikaci.

Metody jsou velmi citlivé na dodržení podmínek preanalytické fáze, včetně užívání léků a složení stravy. Klinické oddělení musí vždy informovat laboratoř o případné protidestičkové léčbě pacienta. Výsledky vyšetření je nezbytné interpretovat komplexně ve spojení s anamnestickými údaji o pacientovi a dalšími laboratorními nálezy.

Reference

1. ANGIOLILLO, Dominick, Sergio BUCCHERI a Loredana BURY. Platelets: Practical manual. Spain: Ambos Marketing Services, 2019. ISBN 978-84-949430-5-8.

2. LABORATORNÍ SEKCE ČESKÉ HEMATOLOGICKÉ SPOLEČNOSTI ČLS JEP. Referenční meze krevního obrazu, retikulocytů, normoblastů a diferenciálního počtu leukocytů dospělých [online]. Laboratorní sekce České hematologické společnosti ČLS JEP, 18. 6. 2021 [cit. 2021-12-23]. Dostupné z: https://labsekce.hematology.cz/ wp-content/uploads/2021/08/Doporuceni_LS_CHS_CLS_JEP-Referencni_mezekoagulace_v7.pdf

3. PENKA, Miroslav a Eva SLAVÍČKOVÁ. Hematologie a transfuzní lékařství. Praha: Grada, 2011. ISBN 978-80-247-3459-0.

4. PECKA, Miroslav a Milan BLÁHA. Praktická hematologie: laboratorní metody. Vyd. 1. Český Těšín: Infiniti art, 2010. ISBN 978-80- 903871-9-5.

5. OLHMANN, P. Platelet aggregometry: Platelet Function Testing. Paris, France: Stago Group.

6. Multiplate® – POC analyzátor krevních destiček [online]. Roche s.r.o. [cit. 2023- 07-03]. Dostupné z: https://www.poct. cz/multiplatec8a1b-48a2-ed11-1a91- 005056a71a5d?countryIsoCode=cz

7. Roche s.r.o. [online]. Roche s.r.o., Diagnostics Division [cit. 2022-02-25]. Dostupné z: https://diagnostics.roche.com/ cz/cs/products/instruments/multiplate-6- analyzer.html

8. ADPtest [online]. Sandhofer Strasse 116, D-68305 Mannheim: Roche Diagnostics GmbH, 2023 [cit. 2023-07-10]. Dostupné z: https://elabdoc-prod.roche.com/eLD/api/ downloads/d5dc8a1b-48a2-ed11-1a91- 005056a71a5d?countryIsoCode=cz

9. ŠIGUTOVÁ, Pavla, Ilona FÁTOROVÁ, Ingrid HRACHOVINOVÁ a kol. Preanalytika v hematologické laboratoři [online]. Laboratorní sekce České hematologické společnosti, 2021 [cit. 2023-07-11]. Dostupné z: https://labsekce.hematology.cz/ wp-content/uploads/2021/08/Doporuceni_ LS_CHS_CLS_JEP-Preanalytika_v_ hematologicke_laboratori_v01.pdf

10. SCHARF, Rüdiger E. Drugs that affect platelet function. Semin Thromb Hemost. 2012, 38(8), 865-883. doi:10.1055/s-0032-1328881. Doi:10.1055/s-0032-1328881, Epub 2012 Oct 30. PMID: 23111864.

11. CALTZIS, Andreas, Michael SPANNAGL a Ralph LORETH. Multiplate platelet function analysis – application and interpretation [online]. [cit. 2023-07-10]. Dostupné z: https://antiplagiarism2014blog.files. wordpress.com/2015/12/sources107.pdf

12. ASPItest [online]. Sandhofer Strasse 116, D-68305 Mannheim: Roche Diagnostics GmbH, 2023 [cit. 2023-07-10]. Dostupné z: https://elabdoc-prod.roche.com/eLD/api/ downloads/0a20f149-79b3-ed11-1a91- 005056a772fd?countryIsoCode=cz

13. KARATOVÁ, Debora a Jan BULTAS. Protidestičková léčba – kde jsme a co můžeme očekávat? Remedia. 2012, 23.

14. Analyzátor Multiplate: Spolehlivý nástroj pro testování funkce krevních destiček [online]. Roche Diagnostics GmbH [cit. 2021-11-15]. Dostupné z: https://diagnostics.roche.com/ cz/cs/products/instruments/multiplate-6- analyzer.html#productInfo

15. Prostaglandin E1 Reagent [online]. Sandhofer Strasse 116, D-68305 Mannheim: Roche Diagnostics GmbH, 2022 [cit. 2023-07-10]. Dostupné z: https://elabdoc-prod.roche.com/eLD/api/ downloads/b9770d26-60af-ec11-1291- 005056a772fd?countryIsoCode=cz

16. TRAPtest [online]. Sandhofer Strasse 116, D-68305 Mannheim: Roche Diagnostics GmbH, 2022 [cit. 2023-07-10]. Dostupné z: https://elabdoc-prod.roche.com/eLD/api/ downloads/5f12732c-259e-ec11-1191- 005056a71a5d?countryIsoCode=cz

17. Multiplate® analyzer: Uživatelská příručka. 3. Germany: Roche Diagnostics GmbH, 2019.

18. Liquid Control Set [online]. Roche s.r.o., Diagnostics Division, 2019 [cit. 2023-07-03]. Dostupné z: https:// elabdoc-prod.roche.com/eLD/api/downloads/52ae8a86-67a0-ec11-1191- 005056a71a5d?countryIsoCode=cz

19. GpIIb/IIIa Antagonist Reagent [online]. Sandhofer Strasse 116, D-68305 Mannheim: Roche Diagnostics GmbH, 2023 [cit. 2023-07-10]. Dostupné z: https://elabdoc-prod.roche.com/eLD/api/ downloads/f75e372f-0c87-e911-f2b5- 00215a9b3428?countryIsoCode=cz

20. PULCER, Martin, Dana MIKULENKOVÁ, Luděk SLAVÍK a kol. Doporučení pro správné zavedení a používání POCT přístrojů měřící hematologické parametry [online]. In: Laboratorní sekce České hematologické společnosti ČLS JEP, 2020 [cit. 2023-07-03]. Dostupné z: https:// labsekce.hematology.cz/wp-content/ uploads/2021/08/Doporuceni_LS_CHS_ CLS_JEP-POCT_v01.pdf

21. BULTASOVA, Lenka, Vladimir ROHAN, Jana ULEHLOVA a Ludek SLAVIK. Monitoring the Antiplatelet Therapy Efficacy in Patients with Acute Ischemic Stroke. Clinical Laboratory [online]. 2023, 69, [cit. 2023-09-05]. ISSN1433-6510. Dostupné z: doi:10.7754/Clin. Lab.2022.220642