Solutions d’amplification et de quantification des banques NGS

Réactifs d’amplification et de quantification de banques NGS précis et à faible biais pour une qualité et un rendement élevés des données de séquençage.

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A lab technician wearing a lab coat sitting at a laboratory bench pipetting NGS sample prep reagents

L’amplification à faible biais et la quantification précise des banques améliorent la qualité des données

Pour garantir une qualité et un rendement élevés des données de séquençage, l’amplification (le cas échéant) et la quantification des banques doivent être effectuées avec une grande précision, un faible biais et une efficacité élevée. Les mélanges d’enzymes pour l’amplification des banques KAPA et la quantification des banques NGS contiennent des enzymes spécialement conçues pour être efficaces sur une large gamme de teneurs en GC et de tailles de fragments. 

L’ADN polymérase KAPA HiFi, l’enzyme contenue dans les ReadyMixes KAPA EvoAmp et les trousses d’amplification de banques KAPA mis à jour, offre une fidélité exceptionnelle afin de limiter l’introduction d’erreurs lors de l’amplification de banques NGS1. Les trousses de quantification de banques KAPA contiennent l’enzyme KAPA SYBR FAST conçue pour une qPCR i à base de SYBR Green I robuste et reproductible2.

Amplification des banques NGS

La plupart des flux de travail NGS comprennent au moins une étape d’amplification des banques, notamment les flux de travail ADN (à l’exception du SGE sans PCR), la plupart des flux de travail de séquençage de l’ARN et la plupart des flux de travail NGS ciblés. L’amplification joue les rôles suivants dans la préparation des banques NGS :

  1. Générer suffisamment de matériel pour l’étape suivante du flux de travail : par exemple, pour améliorer la capacité à détecter les ADNc en faible quantité ou augmenter la masse de l’échantillon avant l’enrichissement des cibles 
  2. Ajouter des séquences d’index NGS lorsque des adaptateurs universels tronqués sont utilisés pour convertir des fragments d’ADN ou d’ADNc en molécules de banque (les adaptateurs pleine longueur contiennent des index et peuvent être utilisés lorsque des flux de travail sans PCR sont souhaités)

Ainsi, une amplification précise et à faible biais des banques est essentielle pour s’assurer que les données finales représentent l’échantillon d’origine, en particulier lorsque l’ADN d’entrée se compose de faibles quantités ou d’acides nucléiques de mauvaise qualité tels que l’ADNtc ou l’ADN FFPET, qui peuvent nécessiter davantage de cycles d’amplification.

Quantification des banques NGS

La quantification des banques NGS peut être effectuée à plusieurs étapes d’un flux de travail. Par exemple :

  1. La quantification des banques indexées avant le regroupement pour l’enrichissement des cibles (capture multiplexée) garantit que chaque échantillon est représenté de manière égale dans la réaction de capture.  
  2. La quantification des banques post-capture ou des banques non enrichies avant le séquençage permet d’assurer une génération optimale de grappes sur l’instrument, ce qui est important tant pour l’efficacité du séquençage que pour la qualité des données.

Les méthodes basées sur la qPCR, telles que la trousse d’amplification de banque KAPA, sont plus précises pour quantifier les molécules de banque séquencables que d’autres méthodes, telles que les méthodes fluorométriques ou électrophorétiques, car elles ne reconnaissent que les fragments de banque séquencables ; les autres méthodes incluent également des fragments de banques incomplets dans leurs résultats.

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Avantages des solutions d’amplification et de quantification des banques NGS de Roche

Faible biais

Amplification à haute efficacité et faible biais pour tous les flux de travail NGS nécessitant une PCR

La PCR avec des ADN polymérases traditionnelles est connue pour introduire des biais, compromettant ainsi les données NGS3. Les solutions d’amplification des banques KAPA de Roche contiennent l’ADN polymérase HiFi KAPA, très appréciée dans l’amplification des banques NGS en raison de sa capacité à amplifier des populations d’ADN complexes avec une fidélité exceptionnelle, une grande efficacité et un faible biais4.

  • KAPA EvoAmp ReadyMix, KAPA HiFi HotStart ReadyMix et toutes les trousses d’amplification de banques KAPA offrent une efficacité d’amplification élevée sur un large éventail de longueurs de fragments, de teneurs en GC et de motifs de séquençage, réduisant ainsi le nombre de cycles PCR nécessaires pour obtenir des taux de réussite élevés avec des échantillons courants ou complexes5
  • L’amplification hautement efficace et à faible biais préserve la complexité des banques NGS afin de garantir des résultats de séquençage représentatifs de l’échantillon d’origine.
  • L’amplification à faible biais est essentielle pour obtenir une uniformité de couverture élevée, ce qui réduit les taux d’abandon et de duplication et contribue à améliorer la rentabilité du séquençage6
Fidélité exceptionnelle

De faibles taux d’erreur d’amplification se traduisent par des données NGS de haute précision

L’amplification des banques NGS par PCR est sujette aux erreurs, en partie en raison des propriétés inhérentes aux ADN polymérases1. L’ADN polymérase KAPA HiFi est dérivée d’une polymérase de la famille B et a été conçue pour présenter une activité exonucléase 3’→5’ (correction) améliorée.

  • L’amplification des banques NGS à l’aide des solutions d’amplification des banques KAPA de Roche réduit le nombre total d’erreurs qui s’accumulent pendant le processus de préparation des échantillons, ce qui permet d’obtenir des résultats de séquençage plus précis.
  • L’amplification de banque à fidélité exceptionnelle simplifie l’analyse et l’interprétation des données NGS et minimise le besoin de stratégies supplémentaires de correction d’erreurs tout au long du processus, de l’échantillon à la séquence.

 

Peu onéreuse

Une quantification fiable des banques NGS permet une utilisation optimale de la capacité de séquençage

Le séquençage représente toujours une part importante du coût global de tout projet, en particulier lorsqu’une couverture élevée ou un séquençage approfondi est nécessaire. Afin d’optimiser le rendement du séquençage, il est essentiel d’obtenir une quantité optimale de données à partir de chaque cycle de séquençage, ainsi que le nombre souhaité de lectures à partir de chaque échantillon du cycle.

Les trousses de quantification de banques KAPA constituent une solution efficace basée sur la qPCR pour quantifier les banques NGS. Facilement utilisables dans n’importe quel laboratoire de biologie moléculaire, ces trousses sont parfaites pour la quantification de routine de banques individuelles ou d’échantillons regroupés avant le séquençage ou l’enrichissement des cibles.

  • Contrairement à d’autres méthodes de quantification, telles que celles utilisant la spectroscopie UV, la fluorométrie ou l’électrophorèse, la quantification des banques NGS par qPCR ne compte que les molécules des banques dont les deux adaptateurs sont dans la bonne orientation pour le séquençage
  • Les trousses utilisent un seul étalon d’ADN prédilué pour tous les types de banques et sont soumises à un contrôle qualité rigoureux afin de garantir la cohérence d’un lot à l’autre et de limiter la dérive des données
  • Les trousses de quantification de banque KAPA ne nécessitent aucun équipement ou compétence particulière et se prêtent parfaitement à l’automatisation

Découvrez également

Les produits KAPA sont réservés exclusivement à la recherche et non aux procédures diagnostiques.

Références

  1. Données internes de F. Hoffmann-La Roche Ltd.
  2. Données internes de F. Hoffmann-La Roche Ltd.
  3. Quail MA, et al. Optimal enzymes for amplifying sequencing libraries. Nat Methods. 2011;9(1):10-1. 
  4. Données internes de F. Hoffmann-La Roche Ltd.
  5. Données internes de F. Hoffmann-La Roche Ltd.
  6. Données internes de F. Hoffmann-La Roche Ltd.
  7. McInerney P, et al. Error Rate Comparison during Polymerase Chain Reaction by DNA Polymerase. Mol Biol Int. 2014;:287430.