Polymerázová řetězová reakce (PCR) je účinná a levná metoda kopírování nebo „amplifikace“ malých segmentů DNA nebo RNA.
Metoda PCR dokáže vyrobit miliony kopií úseku DNA za několik málo hodin a tak zajistit dostatečné množství DNA pro požadovanou analýzu. Tento inovativní, a přitom jednoduchý postup umožňuje lékařům diagnostikovat a sledovat onemocnění s použitím minimálního množství vzorku např. krve nebo tkáně.
Co je PCR?
Příprava vzorku metodou PCR se provádí in vitro v laboratoři a je založena na přirozeném procesu replikace DNA. V nejjednodušší podobě reakce probíhá ve zkumavce po smíchání vzorku DNA, DNA polymerázy, nukleotidů, primerů a dalších reagencií. Jejich úkolem je usnadnit reakci potřebnou pro kopírování DNA.
Metoda PCR dokáže nejen detekovat onemocnění ve vzorku, ale umožní i sledování množství přítomného viru neboli virové nálože v lidském těle. Při onemocněních jako je hepatitida typu C nebo HIV je virová nálož jedinečným ukazatelem toho, jak moc se nemoc u pacienta projeví, anebo jak dobře zabírá lék či terapie. Na základě získaných informací mohou lékaři rozhodnout o zahájení léčby nebo posoudit odezvu pacienta na danou léčbu a podle toho ji pak uzpůsobit.
Každý PCR cyklus se skládá ze tří pevně daných kroků a vede přibližně ke zdvojnásobení cílové DNA. Jde o exponenciální reakci, takže 30 až 40 PCR cyklů vytvoří více než miliardu kopií původní neboli „cílové“ DNA.
Příprava vzorku
Před zahájením PCR je nutné ze vzorku izolovat DNA. Extrakce DNA je vícekrokový proces, který lze provádět manuálně nebo pomocí např. COBAS® AmpliPrep – prvního přístroje, který připravuje vzorky automaticky bez zásahu člověka. Jakmile jsou vzorky připraveny, může začít tříkrokový proces PCR.
1. Separace cílové DNA – denaturace
Během prvního kroku PCR, zvaného denaturace, se zkumavka obsahující vzorek DNA zahřeje na teplotu přesahující 90 °C, což vede k rozvolnění dvoušroubovice DNA na dvě samostatná vlákna. Vysoká teplota totiž naruší relativně slabé vazby mezi nukleotidy řetězců DNA.
2. Navázání primerů na DNA
PCR nekopíruje všechnu DNA ve vzorku. Kopíruje pouze velmi specifickou sekvenci genetického kódu definovaných pomocí PCR primerů. Například chlamydie mají unikátní sekvenci, která je specifická pouze pro tuto bakterii. PCR se může zaměřit na tuto sekvenci DNA, kterou jiné druhy baterií nemají. Toto je možné díky primerům, což jsou uměle vyrobené oligonukleotidy (krátké kousky syntetické DNA), které se navážou na dané sekvence po obou stranách cílové oblasti v DNA. V tomto druhém (PCR) kroku se používají dva primery – jeden pro každé separované vlákno DNA. Primery se navážou na začátek sekvence, která má zkopírovat, a označí tuto sekvenci pro třetí PCR krok. Během druhého kroku se zkumavka ochladí, přičemž navázání primerů proběhne v rozmezí teplot mezi 40–60 °C. Krok dvě vede k získání dvou samostatných DNA vláken se sekvencemi ohraničenými primery. Obě vlákna jsou připravená na zkopírování.
3. Vytvořené kopie – elongace
Ve třetí fázi reakce, nazývané elongace, se teplota zvýší přibližně na 72 °C. Nukleotidy v roztoku se přidají k navázaným primerům pomocí DNA polymerázy a vytvoří nové vlákno DNA, které je komplementární k původnímu vláknu. Začíná se přitom v oblastech označených primery. Výsledkem elongace jsou dvě identické kopie originální DNA.
Po vytvoření dvou kopií DNA metodou PCR se celý cyklus opakuje, tentokrát s použitím nové, duplikované DNA. Z každého duplikátu se vytvoří další dvě nové kopie a přibližně po 30 nebo 40 PCR cyklech již existuje více než miliarda kopií původního segmentu DNA. Protože proces PCR je automatický, stačí na jeho provedení jen několik málo hodin. Ve zdravotnictví lze využít metodu PCR k vytvoření dostatečného počtu kopií cílové DNA z klinického vzorku pro potřeby analýzy. Výsledky těchto diagnostických a monitorovacích testů dávají lékařům a dalším poskytovatelům zdravotní péče informace pro vedení léčby.
