Qu'est-ce que la PCR ?

PCR : comment copier une séquence l'ADN

 

L’amplification en chaîne par polymérase (PCR) est un moyen efficace et rentable de copier ou d'amplifier de petits segments d'ADN ou d'ARN.

Grâce à la PCR, des millions de copies d'une séquence d'ADN sont fabriquées en quelques heures seulement, ce qui permet d'obtenir la quantité d'ADN nécessaire pour l'analyse. Cette méthode innovante et simple permet aux cliniciens de diagnostiquer ainsi que de surveiller les maladies et nécessite une petite quantité d'échantillons, tels que le sang ou les tissus.

 

Qu'est-ce que la PCR ?

La préparation de l'échantillon pour la PCR s’effectue in vitro, c’est-à-dire à l'extérieur du corps, en laboratoire. Elle est basée sur le mécanisme naturel de la réplication de l'ADN. Dans sa forme la plus simple, la réaction se produit lorsqu'on ajoute à un échantillon d'ADN une polymérase d'ADN, des nucléotides, des amorces ainsi que d'autres réactifs ou composés chimiques artificiels. Les réactifs facilitent la réaction nécessaire pour copier le fragment d’ADN.

En plus de détecter la présence de maladies dans un échantillon, la PCR permet de contrôler la quantité de virus présente, c’est-à-dire la charge virale, dans le corps d'une personne. Dans le cas de maladies telles que l'hépatite C ou le virus de l'immunodéficience humaine (VIH), la charge virale donne une bonne indication de l’état de santé d'une personne contaminée ou de l'efficacité de ses médicaments et de son traitement. Grâce à ces informations, les médecins peuvent déterminer quand commencer le traitement ainsi que la réponse du patient, ce qui permet de personnaliser le traitement en fonction de chaque individu.

Chaque cycle de PCR est constitué de trois étapes et double approximativement la quantité d'ADN cibles obtenue. Il s'agit d'une réaction exponentielle, de sorte que 30 à 40 cycles de PCR permettent de produire plus d'un milliard de copies de la séquence d'ADN recherchée (aussi appelée « ADN cible »).

 

La préparation des échantillons

Avant de commencer l’amplification, la séquence d’ADN doit être isolée à partir d'un échantillon. L'extraction de l'ADN est un processus à plusieurs étapes pouvant être effectué manuellement ou à l'aide d'un instrument comme le COBAS® AmpliPrep, le premier appareil à préparer les échantillons sans intervention humaine. Après la préparation de l'échantillon, le cycle PCR composé de trois étapes peut démarrer.

 

1. La dénaturation de l'ADN 

Au cours de la première étape, le tube contenant l'échantillon d'ADN est chauffé à plus de 90°C (194 degrés Fahrenheit), de manière à séparer les deux brins qui composent l'ADN. La température élevée permet de briser les liens relativement faibles entre les nucléotides présents dans l'ADN.

 

2. L’hybridation des amorces

La technique PCR ne copie pas l’intégralité de la séquence l'ADN présente dans l'échantillon. Elle ne copie qu'une séquence très spécifique du code génétique qui est ciblée par les amorces. Par exemple, la chlamydia possède un modèle unique de nucléotides propre à la bactérie. La PCR répliquera uniquement les séquences d'ADN spécifiques à la chlamydia. Pour ce faire, la PCR utilise des amorces : les oligonucléotides. Il s’agit de petits segments d'ADN conçus pour trouver un segment spécifique de l’ADN cible. Deux amorces sont utilisées lors de la deuxième étape : une pour chaque brin d'ADN individuels venant d’être séparés. Les amorces se fixent au début de la séquence qui sera copiée, la marquant ainsi pour l'étape trois. Au cours de la deuxième étape, le tube est refroidi, car l’hybridation des amorces se produit entre 40 et 60°C (104 - 140 degrés Fahrenheit) . La deuxième étape permet d’obtenir deux brins d'ADN séparés dont les séquences sont marquées par des amorces. Les deux brins sont prêts à être copiés.

 

3. L’élongation

Dans la troisième phase de la réaction, la température est portée à environ 72°C (161,5 degrés Fahrenheit). Une enzyme polymérase complète la synthèse du brin d'ADN à partir de l'amorce grâce aux nucléotides présents, de manière à créer un nouveau brin d'ADN complémentaire à chaque brin d’ADN. Une fois l'élongation terminée, deux copies identiques de l'ADN original sont obtenues.

Ce cycle est répété avec l’ADN dupliqué. Chaque cycle permet de doubler le nombre de copies. Il est ainsi possible d’obtenir plus d’un milliard de copies de la séquence d’ADN recherchée en une trentaine de cycles. Lorsqu’automatisé, ce processus peut être complété en quelques heures seulement. Dans les établissements de santé, la PCR permet d’obtenir suffisamment de copies de l'ADN cible pour permettre de nombreuses analyses. Les résultats de ces tests de diagnostic et de surveillance fournissent aux cliniciens et autres prestataires de soins de santé des informations permettant d’orienter le traitement des patients.