Měření CRP v režimu POCT na přístroji cobas^® b 101 a jeho srovnání s metodou v centrální laboratoři

RNDr. Veronika Kučerová, Ph.D., RNDr. Mgr. Isabela Pospíšilová, prof. RNDr. David Friedecký, Ph.D., MUDr. Vojtěch Němeček
Oddělení klinické biochemie, Fakultní nemocnice Olomouc

ÚVOD

C-reaktivní protein (CRP) je široce využívaný biomarker akutní fáze zánětu s klíčovou úlohou v diferenciální diagnostice bakteriálních a virových infekcí i v monitoraci dynamiky zánětlivého procesu. Díky své rychlé kinetice a relativně snadné interpretaci výsledků je CRP běžnou součástí laboratorního panelu urgentní medicíny, primární péče i pediatrie. Zejména v primární péči patří akutní infekce respiračního traktu mezi nejčastější důvody vyhledání lékařské péče, které často vedou k nevhodné preskripci antibiotik, což souvisí s hlavní příčinou vzniku antibiotické rezistence.¹

POCT (Point-of-Care Testing) označuje laboratorní vyšetření prováděné přímo u pacienta nebo v jeho blízkosti.²

Je-li CRP vyšetřeno metodou v režimu POCT, přináší to tyto výhody:

• rychlá dostupnost výsledku (během několika minut), což umožňuje okamžité klinické rozhodnutí – například zda nasadit antibiotika, či nikoli, zejména při podezření na bakteriální infekci;
• minimalizace zbytečné antibiotické terapie, čímž se snižuje riziko antibiotické rezistence;
• úspora času a nákladů spojených s odesíláním vzorku do laboratoře;
• zvýšení komfortu pro pacienta, protože odečet probíhá na místě z malého vzorku kapilární krve (v řádech mikrolitrů).

Měření CRP v režimu POCT jednoznačně umožňuje efektivnější rozhodování o dalším diagnostickém i terapeutickém postupu. Tento přínos je však podmíněn nejen jednoduchostí obsluhy a použití, ale především spolehlivými analytickými vlastnostmi testu: opakovatelností, přesností a srovnatelností výsledků s centrální laboratoří. Přístroje POCT se nezřídka liší svou přesností a precizností, což může vést k významným rozdílům ve srovnání s centrálními laboratorními analyzátory. V ideálním případě by výsledky z analyzátorů POCT měly vykazovat statisticky a klinicky akceptovatelnou míru shody s výsledky centrální laboratoře, tak aby byly naplněny benefity těchto vyšetření s ohledem na bezpečnost pacienta. Z pohledu klinické biochemie je proto nezbytné hodnotit výkonnost každého POCT systému v celém rozsahu klinicky relevantních koncentrací CRP, a to jak z hlediska analytických parametrů, tak z pohledu možného vlivu na klinické rozhodování.

Jedním z přístrojů umožňujících měření C-reaktivního proteinu u pacienta je přístroj cobas® b 101 společnosti Roche, viz Obr. 1.

Obr. 1: Analyzátor cobas® b 101, Roche

POPIS METODY A PŘÍSTROJE cobas® b 101

Materiál

Kapilární plná krev, sérum, v případě potřeby také venózní plná krev nebo plazma s K₂/K₃ EDTA nebo heparinem lithným.

Odběr materiálu, provedení

Vzorky jsou zpravidla odebírány přímo do reagenčního disku (Obr. 2), který obsahuje modře značenou komůrku umožňující při přiložení ke kapce kapilární krve její samovolné vzlínání (Obr. 3). Při použití plné krve, séra nebo plazmy lze tyto aplikovat také pomocí pipety. Pro korektní výsledek měření je nezbytně nutné, aby komůrka byla zcela zaplněna materiálem (Obr. 4). Následně uživatel disk pevně uzavře.

Po (volitelném) zadání identifikace obsluhy a pacienta pomocí ovládací obrazovky přístroje, je disk vložen do přístroje, analýza je spuštěna automaticky (Obr. 5). Výsledky měření lze automaticky přenášet do SW vzdálené správy, LIS/NIS apod. K přístroji je možné připojit pomocí USB rozhraní čtečku čárových kódů a tiskárnu.

Obr. 2: Reagenční disk

Obr. 3: Odběr kapilární krve do reagenčního disku

Obr. 4: Reagenční disk naplněný krví (modře označená komůrka)

Obr. 5: Umístění reagenčního disku do přístroje

Obr. 6: Intuitivní ovládací menu v českém jazyce

Princip

Při zahájení analýzy dojde k automatické centrifugaci vzorku přístrojem. Vzorek plazmy je následně naředěn HEPES pufrem (kyselina N'-2-hydroxyethylpiperazin-N'-2 ethansulfonová) a přenesen automaticky do reakční komůrky, kde je smíchán s reagencií obsahující protilátky (kozí) proti CRP , navázané na latexové částice. CRP se poté na tyto protilátky naváže. Stanovení koncentrace CRP vychází ze změny absorbance při vlnových délkách 525 nm a 625 nm, která koreluje s intenzitou aglutinace. Tato metoda byla standardizována dle referenčního materiálu ERM DA 472/IFCC Mezinárodní federace klinické chemie a laboratorní medicíny (IFCC). Doba analýzy je 3–4 minuty.³

Informace o kalibrační křivce specifické pro danou šarži kitu jsou automaticky přístrojem načteny z informačního disku kontroly kvality, který je součástí balení.

Specifikace testu včetně stability diagnostických disků je uvedena v tabulce 1.

Kontrolní materiál

Pro kontrolu měření lze využít kapalný kontrolní materiál cobas® CRP Control s definovanými cílovými hodnotami na dvou hladinách. Kontrolní materiál je určen k přímému použití, stabilní 30 dnů při teplotě 2–8 °C. Postup měření je stejný jako u pacientských vzorků.

SROVNÁNÍ S METODOU V CENTRÁLNÍ LABORATOŘI

V souladu s aktuálním Doporučením ČSKB (České společnosti klinické biochemie)⁴ k POCT jsme ve Fakultní nemocnici v Olomouci provedli srovnání měření CRP z plné krve na přístroji cobas® b 101 s akreditovanou metodou vyšetření CRP z plazmy v centrální laboratoři s cílem zhodnotit vzájemnou shodu výsledků.

Metoda v centrální laboratoři

Kvantitativní stanovení koncentrace C-reaktivního proteinu (CRP) v séru nebo plazmě (Li-heparin) je prováděno biochemickým analyzátorem Atellica, Siemens. Test je založen na principu latexově zesílené imunoturbidimetrie měřené při 571 nm. Standardizace této metody je vztažena k referenčnímu materiálu Institutu pro referenční materiály a měření (IRMM) CRM-470. Potřebné množství séra/plazmy je 4 µl (mrtvý objem nezapočítán). Rozsah měření je 4–304 mg/l (při ředění až 912 mg/l). Doba analýzy 8 minut. Výrobce uvádí cílový variační koeficient opakovatelnosti u plazmy na hodnotě 7 mg/l ≤5 %.⁵

Metodika

Bylo srovnáno 67 vzorků pacientů (35 žen, tj. 52 %, 32 mužů, tj. 48 %), medián věku 69,5 let (průměr 64,7 let). Vzorky byly vybírány s ohledem na pokrytí co nejširšího rozsahu měření. Pacienti podepsali informovaný souhlas s odběrem. Vzorek plné krve byl odebrán do zkumavky s K₃EDTA, po dodání vzorků potrubní poštou na OKB (Oddělení klinické biochemie) byl materiál rozdělen na dva alikvoty. Jeden alikvot byl centrifugován 10 minut při 3 600 otáčkách a 8 °C, následně byla plazma ihned vyšetřena na analyzátoru Atellica. Plná krev byla ihned použita pro vyšetření na systému cobas® b 101. Na přístroji cobas® b 101 byla použita šarže 323152-05, na přístroji Atellica šarže 242244. Variabilita mezi šaržemi nebyla testována, avšak výrobce Roche uvádí při porovnání 140 vzorků u 3 různých šarží metody na cobas® b 101 s přístrojem cobas® c 501 Pearsonův korelační koeficient R² = 0,998.³

Výsledky, diskuse

Výsledky byly zpracovány pomocí grafu lineární regrese (Graf 1) a Bland-Altmanova grafu (Graf 2) za využití programu GraphPad. Jako statisticky významné byly vyhodnoceny výsledky testů s p-value <0,05.

Data prokázala silnou lineární závislost mezi hodnotami z obou přístrojů, těsnou shodu při Pearsonově korelačním koeficientu R² = 0,998.

Graf 1: Lineární regrese

Bland-Altmanova analýza prokázala velmi nízký průměrný rozdíl mezi metodami (hodnota bias je 0,26), což ukazuje na minimální systematickou odchylku. Současně při rostoucí koncentraci, zejména nad hranicí pozitivních hodnot svědčících pro bakteriální zánět, nacházíme mírně vyšší hodnoty na cobas® b 101.

Rozdíl ±13 mg/l, zjištěný jako 95% interval shody v Bland-Altmanově grafu, může být klinicky relevantní v nižším rozsahu hodnot CRP (zejména v pásmu 30–60 mg/l), kde ovlivňuje diferenciální diagnostiku virových a bakteriálních infektů a úvahy o nasazení antibiotické terapie. Podrobnější analýza právě tohoto pásma (30–60 mg/l) však ukázala užší rozptyl: 95% interval mezi -1,46 a +5,23 mg/l, s průměrným rozdílem 1,88 mg/l (Graf 3). V tomto pásu tedy analyzátor Atellica Siemens sice poskytuje jednotkově vyšší výsledky než cobas® b 101, klinický význam je však minimální. Při koncentracích nad 100 mg/l, které typicky svědčí pro závažnou bakteriální infekci, má vyšší rozdíl mezi metodami již zanedbatelný význam.

Tyto odchylky upozorňují, že interpretace výsledků měřených na různých analytických systémech (včetně POCT) by měla zohledňovat nejen korelaci metod, ale i pozici hodnoty vzhledem ke klinickým rozhodovacím mezím.

Omezení studie může spočívat ve volbě odběrového materiálu, metoda vyšetření CRP z plazmy firmy Siemens není validována pro plazmu odebranou do K₃EDTA.

Graf 2: Bland-Altmanův graf pro všechna data

Graf 3: Bland-Altmanův graf v intervalu naměřených nižších hodnot; oblast označená obdélníkem zobrazuje rozpětí 30–60 mg/l s hodnotami 95% intervalu mezi -1,46 a +5,23 mg/l, s průměrným rozdílem 1,88 mg/l

Pro hodnocení opakovatelnosti přístroje cobas® b 101 (Roche) bylo zvoleno opakované měření (10x) kontrolního materiálu firmy SEKK použitého jako vzorek B cyklu CRP1/24 s cílovou hodnotou (robustní průměr výsledků účastníků) pro skupinu Roche 52,9 mg/l. Výsledky jsou uvedeny formou tabulky č. 2. Variační koeficient (CV) je velmi nízký: 1,14  %. Samotný výrobce pak uvádí na hladině 39,9 mg/l variační koeficient 2,3 %.³ Podle mezinárodně uznávané databáze biologické variability (Ricos et al., 2014) je žádoucí hodnota analytické variability pro CRP stanovena na ≤21 %.⁶ Námi naměřený CVa systému cobas® b 101 ve výši 1,14 % tedy výrazně překonává běžně požadované limity a svědčí o výborné analytické výkonnosti testu. Odchylka průměrné hodnoty od cílové ve skupině Roche (52,9 vs. 51,79) činí pouze 1,11 mg/l, což představuje relativní odchylku cca 2,1 %. Výsledek tedy splňuje obvyklá akceptační kritéria.

Autoři článku si uvědomují vhodnost vyššího počtu opakování měření, které by poskytlo jistě ještě spolehlivější analýzu.

Závěr

Vzhledem k vysoké korelaci a minimálním odchylkám lze výsledky považovat za vzájemně shodné pro klinickou praxi. Bland-Altmanův graf potvrdil, že mezi přístroji není systematická odchylka a že se rozdíly nacházejí v přijatelných mezích. Tato analýza podporuje jejich vzájemnou kompatibilitu při interpretaci laboratorních hodnot. Výsledky dále svědčí o stabilním měření na přístroji cobas® b 101 (Roche), kdy nebyla zaznamenána žádná významná variabilita mezi jednotlivými opakováními, což potvrzuje vysokou přesnost systému pro danou cílovou hodnotu.

Testováním byla zároveň ověřena robustnost řešení a ovládání přístroje, včetně manipulace s diagnostickým diskem. Ovládání je jednoduché, intuitivní, ovládací menu v češtině (Obr. 6). Práce s diskem prokázala snadné zacházení, bez nutnosti využití pipety. Přístroj tak splňuje požadavky dle Doporučení ČSKB na jednoduchost analytické techniky a principu stanovení.⁴

Pro úplnost dodáváme, že naměřené koncentrace CRP nelze interpretovat bez zohlednění klinických příznaků a bez návaznosti na konkrétní metodu měření (a její analytické charakteristiky v daném rozsahu hodnot). Studie zároveň podtrhuje význam srovnávání POCT systémů s laboratorními metodami právě v diagnosticky citlivých pásmech, kde i malé odchylky mohou ovlivnit klinické rozhodnutí.

Autoři prohlašují, že studie byla provedena bez jakýchkoli obchodních nebo finančních vztahů, které by mohly být vykládány jako potenciální střet zájmů.

Literatura

1. Costelloe C, Metcalfe C, Lovering A, Mant D, Hay AD. Effect of antibiotic prescribing in primary care on antimicrobial resistance in individual patients: systematic review and meta-analysis. BMJ. 2010;340:c2096. doi:10.1136/bmj.c2096.
2. Úřad pro technickou normalizaci, metrologii a státní zkušebnictví, Praha, Česká republika. Zdravotnické laboratoře – Požadavky na kvalitu a kompetenci. ČSN ISO 15189-ed.3. 2023.
3. Pracovní návod výrobce: cobas CRP Test. Roche Diagnostics GmbH, Mannheim; 2022 Jun.
4. Kučerová V, Springer D, Zima T, Rajdl D, Friedecký D. Point-of-care testing (POCT). Doporučení ČSKB pro správné zavádění a používání POCT systémů ve zdravotnických zařízeních. Klin Biochem Metab. 2024;32:108–114. doi:10.61568/kbm.2024.021.
5. Pracovní návod výrobce: C-reaktivní protein_2 (CRP_2). Siemens Healthcare Diagnostics Inc., NY, USA.; 2019 Oct.
6. Ricos C, Alvarez V, Cava F, Garcia-Lario JV, Herndandez A et al. Desirable Biological Variation Database specifications – Westgard QC. [cited 30 May 2025]. Available: https://westgard.com/clia-a-quality/quality-requirements/biodatabase1.html.

Stolní automatický analyzátor cobas® b 101 je zdravotnický prostředek určený pro in vitro testování CRP, HbA1c a lipidů (CHOL-TRIGL-HDL-LDL) z kapilární nebo plné žilní krve (Li-heparin nebo EDTA), plazmy (lipidový panel a CRP) a séra (CRP). Přístroj umožňuje snadné nanášení kapilární krve přímo na disk bez použití dalšího spotřebního materiálu. cobas® b 101 je určený k použití profesionály na klinických pracovištích nebo na místech péče o pacienty.

Roztok cobas CRP Control je diagnostický zdravotnický prostředek in vitro, který se používá ke kontrole kvality testu CRP s reagenčními disky cobas CRP na přístroji cobas® b 101. Jedná se o roztok připravený k přímému použití na bázi lidského séra. Kontrola slouží k monitorování preciznosti a správnosti testu cobas CRP Test. Nastavené koncentrace složek kontrol jsou v nízkém rozmezí (hladina 1) a ve vysokém rozmezí (hladina 2).

Více informací najdete na go.roche.com/Navody.