Superamento dei limiti delle attuali tecnologie di sequenziamento di prossima generazione (NGS)
Poiché Roche Sequencing Solutions mira ad anticipare le esigenze future più rilevanti nel campo della genomica, è evidente che le tecnologie di sequenziamento attualmente disponibili presentano limitazioni che incidono sulla crescente domanda di maggiore velocità, precisione, scalabilità e flessibilità.
Alcune tecnologie di sequenziamento tradizionali si basano su un approccio cycle-based per la lettura delle basi del DNA, un metodo che ritarda l’accesso ai dati utilizzabili. La tecnologia a nanopori a molecola singola oggi disponibile sul mercato affronta in parte questa sfida, ma può risultare limitata da un rapporto segnale-rumore intrinsecamente sfavorevole, dovuto alla ridotta risoluzione spaziale e alla limitata capacità di distinguere in modo netto le diverse nucleobasi.1
Un nuovo approccio al sequenziamento NGS
Roche ha risposto alla crescente domanda di prestazioni avanzate sviluppando una nuova categoria di tecnologia NGS, denominata "sequencing by expansion" (SBX). Questo approccio innovativo al sequenziamento è stato progettato per offrire elevata flessibilità e prestazioni di livello superiore, con un ampio margine di evoluzione per soddisfare le esigenze future. In particolare, SBX offre numerosi vantaggi, tra cui:
- Funzionamento flessibile, adattabile alle esigenze di campionamento
- Accuratezza elevata, con punteggi F1 dimostrati superiori al 99,80% (SNV) e al 99,7% (indel) per i campioni di genoma intero HG001
- Resa estremamente elevata, con la possibilità di generare fino a 7 genomi in 1 ora a >30x e oltre 5 miliardi di letture duplex in un’ora di sequenziamento
- Lunghezze di lettura flessibili, da 50 bp a oltre 1000 bp
- Opzioni di workflow ultra rapido per campioni urgenti, incluso un percorso dal campione al file VCF (variant call format) in meno di 5 ore
- Efficienza dei costi, grazie a un modulo sensore scalabile e riutilizzabile
La tecnologia SBX converte le informazioni del DNA in una molecola più lunga e “espansa”, superando le limitazioni spaziali delle tecnologie a nanopori attualmente disponibili e consentendo un rapporto segnale-rumore più elevato, con conseguente miglioramento dell’accuratezza.2 Questa molecola espansa, denominata Xpandomer, viene successivamente fatta transitare attraverso il nanoporo di proprietà di Roche, permettendo il sequenziamento di singole molecole a velocità estremamente elevate e garantendo un accesso rapido ai dati utilizzabili.
Sequenziamento per espansione: uno sguardo più da vicino
SBX trasforma il DNA densamente compattato in una struttura più estesa, caratterizzata da marcatori distinti ad alta intensità di segnale. Questo approccio consente un sequenziamento rapido e altamente accurato, scalabile in modo flessibile per adattarsi a un’ampia gamma di applicazioni. Guarda il video per maggiori informazioni.
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La tecnologia SBX di Roche si basa su tre elementi fondamentali
La tecnologia SBX utilizza un nostro processo di conversione biochimica per espandere e codificare la sequenza di un template di DNA all’interno di una molecola di Xpandomer.
Gli elementi costitutivi dello Xpandomer sono i nucleotidi trifosfato espandibili o X-NTP. Questi nucleotidi rappresentano reporter ad alto rapporto segnale-rumore, frutto di un avanzato lavoro di ingegneria molecolare. Ogni X-TNP integra: un codice reporter facilmente differenziato, un elemento di controllo della traslocazione (TCE) per un transito altamente controllato dello Xpandomer attraverso il nanoporo, enhancer per una sintesi robusta e affidabile degli Xpandomeri e un legame acido-scindibile per l’espansione post-replicazione.
La sintesi degli Xpandomer consente un’incorporazione precisa degli X-NTP, garantendo un sequenziamento ad alta fedeltà
Ciascuno dei quattro X-NTP facilmente differenziati (uno per ciascuna base) funge da substrato per una replicazione polimerasica template-dipendente. La polimerasi, XP sintasi, è stata progettata con grande accuratezza per incorporare monomeri X-NTP di grandi dimensioni, ottenendo una fedeltà di lettura grezza media superiore al 99,3%, una copertura GC uniforme e lunghezze di lettura estese. Alla reazione di sintesi vengono aggiunte anche frazioni di potenziamento della polimerasi, o PEM, che favoriscono l’incorporazione corretta degli X-NTP nel polimero in crescita.
Stabilizzando la molecola in estensione, le PEM contribuiscono in modo determinante all’aumento della lunghezza delle letture rispetto alle tradizionali tecnologie di sequenziamento a letture brevi. Una volta completata la sintesi della molecola surrogata, i legami acido-scindibili vengono rotti, permettendo allo Xpandomer appena generato di espandersi fino a raggiungere una lunghezza circa 50 volte superiore rispetto alla molecola di DNA originale.
La molecola di Xpandomer viene successivamente fatta transitare attraverso un nanoporo biologico in modo altamente efficiente e accurato.
Il movimento dello Xpandomer attraverso il poro è controllato da impulsi di tensione che fanno avanzare lo Xpandomer nel poro un reporter code alla volta. Durante questa traslocazione, i reporter altamente differenziati vengono misurati tramite una matrice scalabile basata su tecnologia CMOS (complementary metal–oxide–semiconductor), che integra elettrodi, circuiti di rilevamento e conversione analogico-digitale
La matrice CMOS contiene circa otto milioni di micropozzetti (ciascuno dotato di un nanoporo), consentendo una misurazione massivamente parallela e finemente controllata, senza gli effetti di convoluzione tipici del sequenziamento a nanopori tradizionale. Il risultato è la possibilità di misurare, in modo economicamente vantaggioso, centinaia di milioni di basi al secondo, superando l’approccio convenzionale basato sull’incorporazione ciclica e sulla lettura di una singola base per volta.
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La piattaforma di sequenziamento AXELIOS 1 e la tecnologia di sequenziamento per espansione (SBX) sono in fase di sviluppo e non sono disponibili in commercio. Il contenuto di questo materiale riflette i risultati attuali degli studi di ricerca e/o gli obiettivi di progettazione. La piattaforma di sequenziamento AXELIOS 1 basata sulla tecnologia SBX sarà lanciata esclusivamente per scopi di ricerca. Non usare in procedure diagnostiche. AXELIOS è un marchio Roche.
Riferimenti bibliografici:
- Kokoris M et al. Sequencing by Expansion (SBX) – a novel, high-throughput single-molecule sequencing technology. bioRxiv. 2025 Feb 24. Disponibile all’indirizzo: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2025.02.19.639056v1
- Wang Y et al. The evolution of nanopore sequencing. Frontiers in Genetics. 2015;5:449. Disponibile all’indirizzo: doi:10.3389/fgene.2014.00449