KAPA Adapters

• Index-Hopping
• Kreuzkontamination von Barcodes oder Proben
• Matrizenwechsel während der PCR-Amplifikation gepoolter Proben
• Sequencing- oder Analysefehler

Einige dieser Probleme können durch sorgfältiges Adapterdesign und Qualitätskontrolle gemindert werden.

KAPA UDI Adapter sind so konzipiert, dass sie aufgrund der folgenden Eigenschaften zuverlässige Ergebnisse unterstützen:

• Eindeutige Dual-Index-Kombinationen, mit denen Reads mit unerwarteten Barcode-Kombinationen vor der Datenanalyse herausgefiltert werden können
• Strenge Herstellungsverfahren und sequenzbasierte Qualitätskontrolltests, um das Potenzial für eine Fehlzuweisung von Indizes aufgrund von Barcode-Kreuzkontamination zu verringern

Abbildung 1. Die eindeutige duale Indexierung mindert die Auswirkungen einer falschen Indexzuweisung während des Multiplex-Sequencing für strukturierte Flowcells.

Jeder Punkt in diesem Datensatz repräsentiert eine PCR-freie Library des gesamten humanen Genoms, sequenziert in Pools von 8 (schwarz) oder 24 (blau) auf Illumina HiSeq X Geräten. Die mit VerifyBamID berechneten Kontaminationsraten spiegeln eine potenzielle Kreuzkontamination der Probe auf Basis der Genotypanalyse wider. Index-Hopping trägt zu den beobachteten Kontaminationsraten bei und wurde durch die Implementierung der nicht-redundanten dualen Indexierungsstrategie und der in KAPA UDI Adaptern verwendeten Barcodes (anstelle des ursprünglichen einfachen Indexierungs-Workflows) deutlich reduziert. Grüne Linien stellen den Mittelwert der Daten dar und rote Linien die oberen und unteren statistischen Kontrollgrenzen, die mit JMP analysiert wurden. Daten mit freundlicher Genehmigung des Broad Institute (Cambridge, MA, USA).

Abbildung 2: Sequencing-basierte Qualitätskontrolltests (QC) von KAPA Adaptern auf Barcode-Kreuzkontamination verbessern die Ergebnissicherheit.

Bei diesem intern entwickelten QC-Assay wird jedes KAPA UDI mit einem eindeutigen, synthetischen, linearen Insert ligiert. Die 96 Libraries werden gepoolt und auf einem Illumina NextSeq™ 500-Gerät sequenziert. Die Datenmenge wird per Subsampling auf 500.000 Reads pro Library reduziert, bevor das Adapter-Trimming und das Alignment mit den synthetischen Referenzsequenzen erfolgen. Ausgerichtete BAM-Dateien werden für abschliessende Berechnungen auf die niedrigste Anzahl alignierter Reads heruntergesampelt. Die hier dargestellte Heatmap ist ein repräsentatives Ergebnis des Barcode-Kreuzkontaminationstests für KAPA UDI Adapter und zeigt den Prozentsatz der Reads an, die mit jeder Kombination aus Inserts (Spalten) und Barcode (Zeilen) verbunden sind. Dunkelgrüne Blöcke über der Diagonalen entsprechen falschen UDI-Insert-Kombinationen. Jeder zweite Block entspricht dem Prozentsatz der Reads für ein bestimmtes Insert, das mit einer der anderen erwarteten Indexkombinationen in der Gruppe von 96 verknüpft ist, und ist entsprechend der Skala auf der rechten Seite gefärbt. Der Test bestätigt, dass Adapter in die richtigen Wells plattiert sind und dass eine Fehlzuweisung des Index, die auf eine Kreuzkontamination mit UDI-Kombinationen zurückzuführen ist, die nicht herausgefiltert werden kann, im Vergleich zu einer Fehlzuweisung aus anderen potenziellen Quellen, wie z. B. Index-Hopping, extrem niedrig ist.*

*Daten mit freundlicher Genehmigung des Broad Institute (Cambridge, MA, USA).

KAPA Adapter produzieren hohe und gleichmässige Umwandlungsraten für Libraries, die sowohl aus Covaris-gescherter als auch aus enzymatisch fragmentierter DNA hergestellt wurden. Diese Konsistenz zeigt die robuste Adapterleistung über verschiedene Library Preparation Workflows hinweg und spricht für zuverlässige Ergebnisse bei einer Vielzahl von Sequencing-Anwendungen.

Abbildung 3: Sequencing-Daten wurden vor der Berechnung der Sequenzabdeckung mit Bedtools auf 27 Millionen Reads pro technischem Replikat heruntergesampelt.

KAPA-Libraries, die aus Covaris-gescherter und enzymatisch fragmentierter DNA hergestellt wurden, ergaben eine ähnliche und relativ enge Verteilung um eine insgesamt höhere durchschnittliche Abdeckungstiefe als Nextera-Libraries, die Regionen mit geringer Abdeckung und Abdeckungs-Hotspots enthielten.

Selbst eine begrenzte Library-Amplifikation kann Bias einführen, was eine ungleichmässige Abdeckung und erhöhte Sequencing-Anforderungen zur Folge hat – insbesondere bei humanen und anderen komplexen Genomen oder bei mikrobiellen Genomen mit extremem Guanin/Cytosin (GC)-Gehalt.

PCR-freie Workflows sind mittlerweile der Goldstandard für das Gesamtgenom-Sequencing (WGS) beim Menschen.

Hochwertige KAPA UDI Adapter in voller Länge unterstützen zusammen mit KAPA EvoPrep Kits und KAPA EvoPlus V2 Kits die flexiblen und hocheffizienten Library Preparation Protokolle, die für PCR-freie humane WGS mit hohem Durchsatz erforderlich sind.

KAPA Adapter sind eine Sammlung hochwertiger Adapter mit eindeutigen Doppelindizes (UDI) für die ligationsbasierte Library Konstruktion. Sie unterstützen ein breites Spektrum von Multiplexing-Stufen (von 2-Plex bis 384-Plex) auf Illumina-Geräten mit sowohl zwei als auch vier Kanälen, die entweder strukturierte oder nicht-strukturierte Flowcells verwenden.

• Minimieren Sie die Auswirkungen von Indexfehlzuweisungen mit KAPA UDI Adaptern voller Länge, einschliesslich 96 Adaptern mit nicht-redundanten Indexkombinationen, oder mit KAPA Universal Adaptern plus KAPA UDI Primer Mixes.
• Erstellen Sie bis zu 384 eindeutig indexierte Libraries mit trunkierten KAPA Universal Adaptern (mit oder ohne UMIs) und KAPA UDI Primer Mixes.