KAPA EvoPrep Boost Kits

• Whole Genome-Shotgun-Sequencing unter Verwendung des optimierten KAPA HyperCap Workflows v4.x
• Targeted Sequencing unter Verwendung von KAPA HyperCap Workflows

• Endreparatur und A-Tailing, wobei endreparierte, 5′-phosphorylierte doppelsträngige DNA (dsDNA)-Fragmente mit 3′-dA-Tailing erzeugt werden
• Adapterligation, bei der dsDNA-Adapter mit 3′-Thymidinmonophosphat (dTMP)-Überhängen an Library-Fragmente mit 3′-dA-Tailing ligiert werden
• Library-Amplifikation (optional), die eine PCR mit hoher Genauigkeit und geringem Bias verwendet, um Library-Fragmente zu amplifizieren, die an beiden Enden geeignete Adaptersequenzen tragen

Der Library Preparation-Prozess, von Endreparatur und A-Tailing bis zur endgültigen Library, kann in ca. 2,3 Stunden durchgeführt werden, abhängig von der Erfahrung des Mitarbeiters, der Anzahl der verarbeiteten Proben und davon, ob eine Library Amplifikation durchgeführt wird. Falls erforderlich kann das Protokoll nach Abschluss der Post-Ligation-Aufreinigung oder der Post-Amplifikations-Aufreinigung sicher angehalten werden.

Gereinigte, adapterligierte Library-DNA kann vor der Amplifikation, dem Target Enrichment und/oder des Sequencing 1 bis 2 Wochen lang bei +2 °C bis +8 °C oder 1 Monat lang bei -15 °C bis -25 °C gelagert werden. Um einen Abbau zu vermeiden, sollte DNA immer in Pufferlösung (10 mM Tris-HCl, pH 8,0 – 8,5) gelagert und die Anzahl der Gefrier-Tau-Zyklen minimiert werden.

• Wenn Sie zwischen Scheren und Endreparatur eine Reinigung durchführen, scheren Sie in 10 mM Tris-HCl (pH 8 oder 8,5) + 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA).
• Wenn Sie zwischen Scheren und Endreparatur keine Reinigung durchführen, scheren Sie in 10 mM Tris-HCl (pH 8 oder 8,5) + 0,1 mM EDTA.
• Scheren Sie DNA niemals in Wasser.

Für die Verwendung mit den KAPA EvoPrep Boost Kits werden KAPA Adapter empfohlen. Wenden Sie sich bei Fragen bezüglich der Kompatibilität und Bestellung von Adaptern von Drittanbietern sowie zu Richtlinien für die Formulierung von durch Benutzer bereitgestellten Library Amplifikations-Primern an den technischen Support.

Informationen zu Barcodesequenzen, Pooling, Kit-Konfigurationen, der Formulierung und der Verdünnung für verschiedene KAPA Kits zur DNA und RNA Library Preparation und den Inputmengen finden Sie in den technischen Datenblättern der KAPA UDI Adapter und KAPA HyperPlex Adapter.

KAPA Adapter werden umfangreichen qPCR- und Sequencing-basierten Funktions- und QC-Tests unterzogen, um Folgendes sicherzustellen:

• Optimale Effizienz bei der Library Preparation
• Minimale Bildung von Adapterdimeren
• Vernachlässigbare Barcode-Kreuzkontamination

Die Effizienz der Library Preparation und die Adapterdimerbildung werden in einem Workflow für die Library Preparation mit geringer Inputmenge bewertet. Die im Assay erzielte Umwandlungsrate zeigt die Effizienz der Library Preparation an. Dies wird berechnet, indem die Ausbeute der adapterligierten Library (vor jeder Amplifikation) durch qPCR (unter Verwendung des KAPA Library Quantification Kits) gemessen und diese als Prozentsatz der Input-DNA ausgedrückt wird. Um die Adapterdimerbildung zu bewerten, wird ein modifiziertes Library Preparation-Protokoll verwendet, das darauf ausgelegt ist, Adapterdimere mit hoher Sensitivität zu messen.

Die neuartige One-Tube-Chemie von KAPA EvoPrep Boost führt zu weniger Adapterdimerbildung und Verschleppung. Eine einzelne Bead-basierte Aufreinigung nach der Adapterligation ist ausreichend, um unbenutzte Adapter und Adapterdimere zu entfernen, selbst bei hohen Adapter:Insert-Molverhältnissen, wie sie für Anwendungen mit geringer Inputmenge empfohlen werden. Falls erforderlich, kann eine zweite Aufreinigung nach der Ligation (oder ein Grössenselektionsschritt) durchgeführt werden, um alle Spuren nicht verwendeter Adapter und Adapterdimere zu entfernen, insbesondere für PCR-freie Workflows.

Wenn die Menge der nach der Post-Ligation-Aufreinigung gewonnenen adapterligierten Library für das nächste Verfahren (z. B. direktes Sequencing) ausreicht und die Library-Moleküle alle für diesen Prozess erforderlichen Adaptermotive enthalten, kann die Library-Amplifikation ausgelassen werden. Dies optimiert den Workflow weiter und verringert die Gesamtdauer der Library Preparation auf unter 2 Stunden. Die mit dem KAPA EvoPrep Boost Kit erreichbare hohe Konversionsrate ermöglicht PCR-freie Workflows mit ≥ 50 ng Input-DNA. Für PCR-freie Workflows sind KAPA EvoPrep Boost Kits, PCR-frei verfügbar (10153806001, 10153814001, 10153857001 und 10154284001).

Nein, KAPA Library Amplifikations-Primer sind separat erhältlich. Dies unterscheidet sich von unseren auf dem Markt erhältlichen KAPA HyperPrep und HyperPlus Kits und wurde für grössere Flexibilität entwickelt. KAPA EvoPrep Boost Kits und KAPA EvoPrep Boost Kits, PCR-frei, sind für WGS, Targeted Sequencing und andere Anwendungen optimiert. Für WGS werden in der Regel Adapter in voller Länge verwendet (diese sind für PCR-freie Workflows essenziell). Für Ganzexom-Sequencing (WES) oder gezieltes Sequencing mit unserem KAPA HyperCap Evolved Workflow v4.x werden trunkierte KAPA HyperPlex Adapter (universell oder mit UMIs) und Indizierung durch PCR (unter Verwendung von KAPA Universal Adapter und KAPA UDI Primer Mixes) empfohlen. Darüber hinaus unterstützen wir Kunden, die es vorziehen, kundenspezifische Adapter oder Index-Primer von Drittanbietern zu verwenden, die speziell für ihre Anwendung(en) entwickelt wurden.

KAPA EvoPrep Boost Kits enthalten eine hochoptimierte Library Amplifikations-Primer-Mischung, die entwickelt wurde, um die Primer-Depletion während der mit KAPA HiFi DNA Polymerase durchgeführten Library Amplifikationsreaktionen zu eliminieren oder zu verzögern. Die Primer in der Mischung basieren auf den Sequenzen von P5- und P7-Illumina-Flow-Cell-Sequenzen und sind für die Amplifikation von Libraries geeignet, die mit Adaptern voller Länge hergestellt wurden. Vom Anwender bereitgestellte Primer-Mischungen können in Kombination mit unvollständigen oder kundenspezifischen Adaptern verwendet werden. Wenden Sie sich bezüglich Richtlinien zur Formulierung von vom Benutzer bereitgestellten Library Amplifikations-Primern an uns.

Wenn bis zum Abschluss Zyklen durchlaufen werden (nicht empfohlen), kann eine einzelne 50μL-KAPA-EvoAmp-Library Amplifikationsreaktion insgesamt 8 – 10 μg an amplifizierter Library erzeugen. Um die Überamplifikation und damit verbundene unerwünschte Artefakte zu minimieren, sollte die Anzahl der Amplifikationszyklen so angepasst werden, dass die optimale Menge an amplifizierter Libraries erzeugt wird, die für nachgelagerte Verfahren erforderlich ist. Diese liegt typischerweise im Bereich von 250 ng bis 1,5 μg der finalen amplifizierten Library.

Die Quantifizierung adapterligierter Libraries vor der Library Amplifikation kann die Optimierung von Library-Amplifikationsparametern erheblich erleichtern, insbesondere wenn ein Library Preparation-Workflow zum ersten Mal eingerichtet oder optimiert wird.

Die Library-Grössenverteilung und die Abwesenheit von Primer-Dimeren und/oder Überamplifikationsprodukten sollten mittels eines elektrophoretischen Verfahrens bestätigt werden. KAPA Library Quantification Kits werden für die qPCR-basierte Quantifizierung von Libraries vor dem Pooling für das Target Enrichment oder das Sequencing empfohlen. Die qPCR-basierte Quantifizierung von adapterligierten Libraries (vor der Library-Amplifikation) kann wertvolle Daten zur Protokolloptimierung und Fehlerbehebung liefern.

Die in diesem Kit enthaltenen ReadyMixes sind temperaturempfindlich, daher ist beim Versand und bei der Lagerung entsprechend Vorsicht geboten. KAPA EvoPrep Boost Kits werden je nach Zielland auf Trockeneis oder mit Kühlakkus versendet. Nach Erhalt sind die gebrauchsfertigen Mischungen sofort bei -15 °C bis -25 °C in einem Gefrierschrank mit konstanter Temperatur aufzubewahren. Bei entsprechender Lagerung und korrekter Handhabung behalten die Kit-Komponenten bis zu dem auf dem Kit-Etikett angegebenen Verfallsdatum ihre volle Aktivität.