KAPA Library Amplification Kits

KAPA EvoAmp ReadyMix ist ideal für die Amplifikation von NGS-Libraries mit geeigneten Adaptersequenzen und die Anreicherung von Zielerfassungssequenzen geeignet, bei denen eine hocheffiziente und hochgradig genaue Amplifikation mit geringem Bias erforderlich ist.

Nein, KAPA Library Amp Primers sind separat erhältlich. Dies unterscheidet sich von unseren auf dem Markt befindlichen KAPA Library Amplifikation Kits. Der Grund dafür ist, dass Kunden je nach Anwendung entweder Adapter voller Länge (KAPA Adapter mit eindeutigen Doppelindizes (UDI)) für die Ganzgenom-Sequencing (WGS) oder trunkierte Adapter (KAPA Universal Adapter + KAPA UDI Primer Mixes) für Target Enrichment Workflows verwenden. Ausserdem wissen wir, dass viele Kunden eigene Adapter von Drittanbietern mit Indexierung von PCR verwenden.

Wenn bis zum Abschluss Zyklen durchlaufen werden (nicht empfohlen), kann eine einzelne Reaktion von 50 μl KAPA EvoAmp ReadyMix insgesamt 8–10 μg an amplifizierter Library erzeugen. Um die Überamplifikation und damit verbundene unerwünschte Artefakte zu minimieren, sollte die Anzahl der Amplifikationszyklen so angepasst werden, dass die optimale Menge an amplifizierter Library erzeugt wird, die für nachgelagerte Verfahren erforderlich ist. Diese liegt typischerweise im Bereich von 250 ng bis 1,5 μg der finalen amplifizierten Library.

Die Quantifizierung adapterligierter Libraries vor der Library Amplifikation kann die Optimierung von Library-Amplifikations-Parametern erheblich erleichtern, insbesondere wenn ein Library-Preparation-Workflow zum ersten Mal eingerichtet oder optimiert wird.

Diese Ausschläge mit höherem Molekulargewicht sind Artefakte der Überamplifikation. Bei Library-Amplifikations-Reaktionen werden Primer typischerweise vor dNTPs abgereichert. Wenn die DNA-Synthese aufgrund von Primer-Depletion nicht mehr stattfinden kann, führen nachfolgende DNA-Denaturierungs- und -Hybridisierungszyklen zur Trennung komplementärer DNA-Stränge, gefolgt von einer unvollständigen Hybridisierung an nicht komplementäre Partner über die Adaptersequenzen. Dies führt vermutlich zur Bildung langer, meist einzelsträngiger, sogenannter „Daisy Chains“, die aus grossen Anordnungen nicht richtig hybridisierter, teilweise doppelsträngiger Heteroduplex-DNA bestehen.

In den meisten Fällen sind „Daisy Chains“ aus Molekülen echte Library-Moleküle, die vorübergehend miteinander hybridisiert werden, um längere Konkatemere zu bilden. Da diese Heteroduplexe signifikante Anteile einzelsträngiger DNA enthalten, führt eine Überamplifikation zu einer Unterquantifizierung von Library-Molekülen bei Assays mit dsDNA-bindenden Farbstoffen. Quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktions (qPCR)-basierte Library-Quantifizierungsverfahren wie der KAPA-Library-Quantifizierungsassay quantifizieren DNA durch Denaturierung und Amplifikation und liefern dadurch ein genaues Mass für die Menge an adapterligierten Molekülen in einer Library, selbst wenn die Library überamplifiziert war.

Die optimale Anzahl von Amplifikationszyklen kann bei Libraries, die aus formalinfixierter, paraffineingebetteter (FFPE) DNA oder anderen anspruchsvollen Proben konstruiert wurden, oder bei Libraries mit einer breiten Fragmentgrössenverteilung 1–3 Zyklen höher sein.

Eine übermässige Library-Amplifikation kann zu unerwünschten Artefakten wie PCR-Duplikaten, chimären Library-Inserts und Nukleotidsubstitutionen führen. Der Umfang der Library-Amplifikation sollte daher so weit wie möglich begrenzt werden, während gleichzeitig sichergestellt wird, dass ausreichend Material für die Qualitätskontrolle und die nachgelagerte Verarbeitung (Sequencing oder Target Enrichment) erzeugt wird.

Der KAPA EvoAmp ReadyMix ist temperaturempfindlich, daher ist beim Versand und bei der Lagerung entsprechend Vorsicht geboten. Der KAPA EvoAmp ReadyMix wird je nach Zielland auf Trockeneis oder Eisbeuteln versendet. Nach Erhalt ist der KAPA EvoAmp ReadyMix sofort bei -15 °C bis -25 °C in einem Gefrierschrank mit konstanter Temperatur aufzubewahren. Bei entsprechender Lagerung und korrekter Handhabung bleibt der KAPA EvoAmp ReadyMix bis zum auf dem Etikett des Kits angegebenen Ablaufdatum vollständig aktiv.