KAPA Library Quantification Kits

Um genaue NGS-Ergebnisse sicherzustellen, ist eine präzise Library-Quantifizierung erforderlich. Der Goldstandard dafür ist qPCR, wobei nur Sequencing-kompetente Fragmente gemessen werden und alle Reagenzien, Standardkurven für verschiedene Library-Typen und essenzielle Datenanalyseunterstützung für erfolgreiche Sequencing-Läufe bereitgestellt werden. Unsere vollständige Library-Lösung umfasst:

• Alle Reagenzien, die für die absolute, qPCR-basierte Quantifizierung einzelner NGS-Libraries oder indexierter Library-Pools benötigt werden
• Standardkurven zur Unterstützung aller Arbeitsabläufe beim Aufbau von Libraries, einschliesslich polymerase-kettenreaktions-freier Methoden (PCR-freier Methoden)
• Quantifizierung von nur/allen Sequencing-kompetenten Library-Fragmenten
• Datenanalysevorlagen und Unterstützung durch den Sequencing-Support. 

Abbildung 1: DNA-Fragmentgrössenverteilungen für eine NGS-Library vor (graue Füllung) und nach qPCR-Amplifikation mit KAPA SYBR FAST und zwei Kits anderer Anbieter, die Wildtyp-Taq-Polymerase enthalten.

Die Reaktionen wurden gemäss dem folgenden Zyklusprotokoll durchgeführt: 95 °C für 10 Minuten, gefolgt von 40 Zyklen bei 95 °C für 10 Sekunden und 60 °C für 45 Sekunden. Das KAPA SYBR FAST-Quantifizierungsprodukt ist repräsentativ für die DNA-Vorlage (NGS-Library), während die mit Wildtyp-Enzymen erzeugten Quantifizierungsprodukte nicht repräsentativ sind.

KAPA Library Quantification Kits enthalten KAPA SYBR FAST DNA Polymerase, die mithilfe unserer Technologie der gerichteten Evolution entwickelt wurde, um diverse DNA-Fragmente mit ähnlicher Effizienz zu amplifizieren. Dies ist wichtig für die Amplifikation der heterogenen Populationen, aus denen NGS-Libraries bestehen. Kits zur Library-Quantifizierung, die nur Wildtyp-DNA-Polymerasen enthalten, zählen nur „einfache“ Library-Moleküle.¹

Die Verwendung eines einzigen, hochgradig konsistenten Satzes von DNA-Standards vereinfacht den Sequencing-Workflow, wodurch keine separaten Standards für verschiedene Library-Typen erforderlich sind. In Kombination mit vorverdünnten Standards mit sehr hoher Konsistenz von Charge zu Charge gewährleistet dies eine genaue und reproduzierbare qPCR-basierte Quantifizierung für alle Library-Quantifizierungsmethoden.

Abbildung 2: KAPA SYBR FAST zeigt eine hocheffiziente Amplifikation und Library-Quantifizierung.

Die mit KAPA SYBR FAST erzielten Amplifikationseffizienzen für zehn diverse Amplikons, dargestellt gegen den Guanin-Cytosin (GC)-Gehalt. Alle zehn Amplikons wurden mit ähnlicher Effizienz amplifiziert (innerhalb des optimalen Bereichs von 95 %–105 %). Dies bestätigt, dass KAPA SYBR FAST das ideale Enzym für die Amplifikation heterogener Populationen von DNA-Fragmenten ist, beispielsweise NGS-Libraries.

Abbildung 3: Hohe Konsistenz über verschiedene Library-Typen und über hunderte Produktionschargen hinweg.

Neun humane Ganzgenom-Sequencings (WGS-Libraries (41 % GC) und zwei mikrobielle WGS-Libraries (Rhodococcus sp., 70 % GC und Staphylococcus sp., 35 % GC) wurden mit unterschiedlichen Chargen (Chargen 1 und 2) und unterschiedlichen Reagenzsätzen derselben Charge (Satz 1 und 2) des KAPA Library Quantification Kit quantifiziert.

Abbildung 4: Hohe Konsistenz über verschiedene Library-Typen und über hunderte von Produktionschargen hinweg.

Amplifikationseffizienzen für 56 aufeinanderfolgende Chargen von KAPA DNA Standards, die seit September 2009 freigegeben wurden.

Ein wesentlicher Faktor für die hochwertige Library Preparation ist das Erreichen optimaler Cluster-Dichten zur Maximierung der Sequencing-Ergebnisse. Dies ist besonders schwierig, wenn mit Proben von schlechter Qualität gearbeitet wird, z. B. mit DNA aus formalinfixiertem, paraffineingebettetem (FFPE-)Gewebe, bei dem es oft zu Abbau kommt. Um diese Herausforderungen zu bewältigen und genaue, qualitativ hochwertige Ergebnisse zu gewährleisten, sind spezialisierte Protokolle und Kits unerlässlich. Wir bieten:

• Optimale und vorhersagbare Clusterdichten zur Maximierung von Sequencing-Kapazität und Durchsatz
• Zuverlässige Ergebnisse für alle Library-Typen, auch aus FFPE-DNA von geringer Qualität

Abbildung 5: Genaue und reproduzierbare Library-Quantifizierung ermöglicht verbesserte und konsistente Clusterdichten.

Die Implementierung des KAPA Library Quantification Kit in den Illumina®-GA-Sequencing-Workflow bei dem Broad Institute (Cambridge, MA, USA) reduzierte die Variabilität der Clusterdichte signifikant und machte Titrationen überflüssig. Die durchschnittliche Anzahl von Clustern pro Kachel wird für aufeinanderfolgende Libraries angezeigt.

Das äquimolare Pooling sorgt dafür, dass jede indexierte Library unabhängig von ihrer anfänglichen Konzentration gleichermassen zum endgültigen Pool beiträgt. Diese Strategie maximiert die Datenqualität und Konsistenz für jede Probe. Unsere Kits gewährleisten:

• Äquimolares Pooling von indexierten Libraries, unabhängig von den Library-Konzentrationen vor dem Pooling
• Gleichmässige Verteilung von Reads auf alle Libraries in einem Pool

Abbildung 6: Genaue und sensitive Quantifizierung ermöglicht eine einheitliche Verteilung von Reads in Multiplex-Sequenzierpools.

Vierundzwanzig indexierte Libraries, die aus hochwertiger humaner genomischer DNA (dunklere Balken) oder FFPE-DNA (hellere Balken) hergestellt wurden, wurden per qPCR unter Verwendung des KAPA Library Quantification Kits für Illumina-Plattformen quantifiziert und kombiniert, um drei Sequencing-Pools mit äquimolarer Konzentration zu erzeugen. Jeder Pool wurde auf einem HiSeq 2500-Gerät in einer anderen Spur derselben Fliesszelle sequenziert. Die 24 einzelnen Libraries stellten einen ~44-fachen Bereich der Konzentrationen vor dem Pooling dar (5,2 nM bis 229,8 nM) (Abb. 6A), während die Verteilung der Sequencing-Reads nur zwischen 9,6 % und 13,9 % variierte (Abb. 6B). Der Variationskoeffizient (CV) für die Konzentration der Library vor dem Poolen betrug 94,9 %, 49,4 % und 127,9 % für die Libraries, die für das Sequencing in den Spuren 1, 2 bzw. 3 gepoolt wurden. Das KAPA Library Quantification Kit ermöglichte ein genaues äquimolares Pooling und reduzierte den CV nach der Normalisierung auf 2,5 %, 4,8 % und 11,2 %.